מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות
Summary
דימות סידן מיקרונדוסקופי In vivo הוא כלי רב ערך המאפשר ניטור בזמן אמת של פעילויות עצביות בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות. עם זאת, יישום טכניקה זו על האמיגדלה היה קשה. פרוטוקול זה נועד לספק קו מנחה שימושי עבור מיקוד מוצלח תאי אמיגדלה עם מיקרוסקופ מיניאטורי בעכברים.
Abstract
ניטור בזמן אמת של פעילויות עצביות בבעלי חיים הנעים בחופשיות היא אחת הגישות המרכזיות לקשר פעילות עצבית להתנהגות. לשם כך, טכניקת דימות in vivo המזהה סידן חולף בנוירונים באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs), מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי, ועדשת שבירה הדרגתית (GRIN) פותחה ויושמה בהצלחה על מבני מוח רבים1,2,3,4,5,6. טכניקת הדמיה זו חזקה במיוחד משום שהיא מאפשרת הדמיה סימולטנית כרונית של אוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית לתקופה ארוכת טווח של עד מספר שבועות. למרות השימושיות, טכניקת הדמיה זו לא יושמה בקלות על מבני מוח המאתרים עמוק בתוך המוח כגון אמיגדלה, מבנה מוח חיוני לעיבוד רגשי וזיכרון פחד אסוציאטיבי7. ישנם מספר גורמים המקשה ליישם את טכניקת ההדמיה על האמיגדלה. לדוגמה, ממצאי תנועה מתרחשים בדרך כלל בתדירות גבוהה יותר במהלך ההדמיה שנערכה באזורי המוח העמוקים יותר מכיוון שמיקרוסקופ להרכבה על הראש המושתל עמוק במוח הוא יחסית לא יציב. בעיה נוספת היא כי החדר לרוחב ממוקם קרוב לעדשת GRIN המושתלת ותנועתו במהלך הנשימה עלולה לגרום לחפצי תנועה לא סדירים מאוד שלא ניתן לתקן בקלות, מה שמקשה על יצירת תצוגת הדמיה יציבה. יתר על כן, מכיוון שתאים באמיגדלה שקטים בדרך כלל במצב מנוחה או הרדמה, קשה למצוא ולמקד את תאי היעד המבטאים GECI באמיגדלה במהלך הליך baseplating להדמיה מאוחרת יותר. פרוטוקול זה מספק קו מנחה מועיל כיצד למקד ביעילות תאים המבטאים GECI באמיגדלה עם מיקרוסקופ מיניאטורי להרכבה על הראש להדמיה מוצלחת של סידן ויוו באזור מוח כה עמוק. יצוין כי פרוטוקול זה מבוסס על מערכת מסוימת (למשל, אינסקופיקס) אך אינו מוגבל אליה.
Introduction
סידן הוא שליח שני בכל מקום, ממלא תפקיד מכריע כמעט בכל פונקציות הסלולר8. בנוירונים, ירי פוטנציאלי פעולה וקלט סינפטי לגרום לשינוי מהיר של חינם תאיים [Ca2+]9,10. לכן, מעקב אחר סידן חולף מספק הזדמנות לפקח על פעילות עצבית. GECIs הם כלים רבי עוצמה המאפשרים ניטור [Ca2+] באוכלוסיות תאים מוגדרות ותאים פנים-תאיים11,12. בין סוגים רבים ושונים של מחוון סידן מבוסס חלבון, GCaMP, בדיקה Ca2 + המבוססת על מולקולת GFP אחת13, הוא GECI אופטימיזציה ביותר ולכן בשימוש נרחב. באמצעות סבבים מרובים של הנדסה, מספר גרסאות של GCaMP פותחה12,14,15,16. אנו משתמשים באחד GCaMP שפותחו לאחרונה, GCaMP7b, בפרוטוקול זה16. חיישני GCaMP תרמו רבות לחקר תפקודי מעגלים עצביים במספר אורגניזמים לדוגמה כגון הדמיה של Ca2 + חולפים במהלך הפיתוח17, בהדמיית vivo בשכבה קליפתית ספציפית18, מדידת דינמיקת מעגלים בלמידה מוטורית19 והדמיה של פעילות הרכב התא הקשורה לזיכרון הפחד האסוציאטיבי בהיפוקמפוס ובאמיגדלה20,21.
הדמיה אופטית של GECIs יש מספר יתרונות22. קידוד גנטי מאפשר ל-GECIs לבוא לידי ביטוי ביציבות לתקופה ארוכת טווח בקבוצת משנה ספציפית של תאים המוגדרים על ידי פרופיל גנטי או דפוסים ספציפיים של קישוריות אנטומית. הדמיה אופטית מאפשרת ניטור בו זמנית של מאות עד אלפי נוירונים בבעלי חיים. כמה מערכות הדמיה אופטית פותחו עבור הדמיה ואנליזה של GECIs בתוך המוח של עכברים מתנהגים בחופשיות עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מיניאטוריים הר הראש21,23,24,25. למרות טכניקת ההדמיה האופטית in vivo המבוססת על GECIs, עדשת GRIN, ומיקרוסקופ מיניאטורי להרכבת ראש להיות כלי רב עוצמה ללמוד את הקשר בין פעילות מעגל עצבי והתנהגות, החלת טכנולוגיה זו על האמיגדלה כבר קשה בשל מספר בעיות טכניות הקשורות מיקוד עדשת GRIN לתאים המבטאים GECIs באמיגדלה מבלי לגרום חפצי תנועה להפחית באופן חמור את איכות רכישת התמונה ומציאת תאים המבטאים GECIs. פרוטוקול זה נועד לספק קו מנחה מועיל עבור הליכים כירורגיים של התקשרות baseplate והשתלת עדשת GRIN כי הם צעדים קריטיים להדמיית סידן אופטי vivo מוצלח באמיגדלה. למרות פרוטוקול זה מטרות האמיגדלה, רוב ההליכים המתוארים כאן הם בדרך כלל ישימים לאזורים אחרים במוח עמוק יותר. למרות שפרוטוקול זה מבוסס על מערכת מסוימת (למשל, Inscopix), ניתן להשיג בקלות את אותה מטרה עם מערכות חלופיות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות ניתוח מיומנת חיוניות להשגת מוצלח בהדמיית סידן אופטי vivo עם מיקרוסקופיה מיניאטורית ראש הר באזורים עמוקים יותר במוח כגון האמיגדלה כפי שתיארנו כאן. לכן, למרות שפרוטוקול זה מספק קו מנחה לתהליכים כירורגיים ממוטבים של חיבור baseplate והשתלת עדשות GRIN, ייתכן שיהיה צורך בתהליכי אופטימיזציה נו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המדע והטכנולוגיה של סמסונג (פרויקט מספר SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
