ناجحة في التصوير الكلسيوم الجسم الحي مع المجهر Miniaturized الرأس جبل في Amygdala من الماوس تتصرف بحرية
Summary
في التصوير المجهري للكالسيوم في الجسم الحي هو أداة لا تقدر بثمن التي تمكن من رصد الوقت الحقيقي للأنشطة العصبية في التصرف بحرية الحيوانات. ومع ذلك، تطبيق هذه التقنية على اللوزة كان من الصعب. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير دليل مفيد لاستهداف خلايا اللوزة بنجاح باستخدام مجهر مصغر في الفئران.
Abstract
في مراقبة في الوقت الحقيقي في الجسم الحي للأنشطة العصبية في الحيوانات تتحرك بحرية هي واحدة من الأساليب الرئيسية لربط نشاط الخلايا العصبية إلى السلوك. لهذا الغرض، تم تطوير تقنية التصوير في الجسم الحي التي تكشف عن عابري الكالسيوم في الخلايا العصبية باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs)، مجهر الفلورانس المصغرة، وعدسة معامل الانكسار التدرج (GRIN) وتطبيقها بنجاح على العديد من هياكل الدماغ1،2،3،4،5،6. هذه تقنية التصوير قوية بشكل خاص لأنها تمكن التصوير المتزامن المزمن لفئات الخلايا المحددة جينياً لفترة طويلة تصل إلى عدة أسابيع. على الرغم من أن مفيدة، هذه التقنية التصوير لم يتم تطبيقها بسهولة على هياكل الدماغ التي تحدد في عمق الدماغ مثل اللوزة، بنية الدماغ الأساسية للمعالجة العاطفية وذاكرة الخوف النقابي7. هناك عدة عوامل تجعل من الصعب تطبيق تقنية التصوير على اللوزة. على سبيل المثال، تحدث القطع الأثرية للحركة عادة بشكل أكثر تكرارًا أثناء التصوير الذي يتم إجراؤه في مناطق الدماغ الأعمق لأن مجهرًا على شكل رأس مزروع في عمق الدماغ غير مستقر نسبيًا. مشكلة أخرى هي أن البطين الجانبي يتم وضعه بالقرب من عدسة GRIN المزروعة وحركته أثناء التنفس قد يسبب التحف الحركة غير منتظمة للغاية التي لا يمكن تصحيحها بسهولة، مما يجعل من الصعب تشكيل عرض التصوير مستقرة. وعلاوة على ذلك، لأن الخلايا في اللوزة عادة ما تكون هادئة في حالة الراحة أو التخدير، فمن الصعب العثور على الخلايا المستهدفة والتركيز التي تعبر عن GECI في اللوزة أثناء إجراء الطلاء الأساسي للتصوير في وقت لاحق. يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفيدة لكيفية استهداف الخلايا بفعالية التعبير عن GECI في اللوزة مع مجهر مصغر على جبل الرأس للنجاح في تصوير الكالسيوم في مثل هذه المنطقة الأعمق في الدماغ. ويلاحظ أن هذا البروتوكول يستند إلى نظام معين (على سبيل المثال، إنسكوبيكس) ولكنه لا يقتصر عليه.
Introduction
الكالسيوم هو رسول الثانية في كل مكان، ولعب دورا حاسما في وظائف كل خلية تقريبا8. في الخلايا العصبية, إطلاق العمل المحتملة والمدخلات متشابك يسبب التغير السريع من الحر داخل الخلية [كاليفورنيا2+]9,10. لذلك، تتبع عابري الكالسيوم يوفر فرصة لمراقبة نشاط الخلايا العصبية. GECIs هي أدوات قوية تسمح بالرصد [Ca2+]في مجموعات الخلايا المحددة والمقصورات داخلالخلوية 11،12. من بين العديد من أنواع مختلفة من البروتين القائم على مؤشر الكالسيوم، GCaMP، Ca2 + مسبار على أساس جزيء GFPواحد 13، هو الأكثر الأمثل، وبالتالي تستخدم على نطاق واسع GECI. من خلال جولات متعددة من الهندسة ، تم تطوير عدد من المتغيرات من GCaMP12،14،15،16. نحن نستخدم واحدة من GCaMPs التي تم تطويرها مؤخرا ، GCaMP7b ، في هذا البروتوكول16. وقد ساهمت أجهزة الاستشعار GCaMP بشكل كبير في دراسة وظائف الدوائر العصبية في عدد من الكائنات الحية النموذجية مثل تصوير Ca2 + العابرين خلال التنمية17، في التصوير في الجسم الحي في طبقة القشريةالمحددة 18، وقياس ديناميات الدوائر في تعلم المهام الحركية19 والتصوير من نشاط الفرقة الخلية ذات الصلة مع ذاكرة الخوف النقابي في قرن آمون وamgdala20،21.
التصوير البصري من GECIs له العديد من المزايا22. الترميز الجيني تمكن GECIs من التعبير عنها بشكل ثابت لفترة طويلة الأجل من الزمن في مجموعة فرعية محددة من الخلايا التي يتم تعريفها من خلال الملامح الوراثية أو أنماط محددة من الاتصال التشريحي. التصوير البصري تمكن في الرصد المتزامن المزمن في الجسم الحي من المئات إلى الآلاف من الخلايا العصبية في الحيوانات الحية. وقد تم تطوير عدد قليل من أنظمة التصوير البصري لفي التصوير في الجسم الحي وتحليل GECIs داخل الدماغ من الفئران تتصرف بحرية مع رئيس جبل المجاهر الفلورية المصغرة21,23,24,25. على الرغم من تقنية التصوير البصري في الجسم الحي على أساس GECIs ، عدسة GRIN ، والمجهر المصغر على الرأس كونه أداة قوية لدراسة الصلة بين نشاط الدائرة العصبية والسلوك ، فإن تطبيق هذه التقنية على اللوزة كان صعبًا بسبب العديد من المشكلات التقنية المتعلقة باستهداف عدسة GRIN للخلايا التي تعبر عن GECIs في اللوزة دون التسبب في القطع الأثرية المتحركة التي تقلل بشدة من جودة اكتساب الصور وإيجاد خلايا تعبر عن GECIs. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير دليل مفيد للإجراءات الجراحية لمرفق اللوح الأساسي وغرينس عدسة التي هي خطوات حاسمة لنجاح في التصوير بالكالسيوم في الجسم الحي في اللوزة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستهدف اللوزة، فإن معظم الإجراءات الموصوفة هنا تنطبق عادة على مناطق الدماغ الأعمق الأخرى. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول يستند إلى نظام معين (مثل إنسكوبيكس)، فإن الغرض نفسه قد يتحقق بسهولة مع نظم بديلة أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات الجراحة ماهرا ضرورية لتحقيق النجاح في التصوير بالكالسيوم البصرية vivo مع المجهر مصغرة الرأس جبل في مناطق الدماغ أعمق مثل اللوزة كما وصفنا هنا. لذلك، على الرغم من أن هذا البروتوكول يوفر إرشادات للعمليات الجراحية المحسنة لمرفقات اللوح الأساسي وغرينس عدسة زرع، قد تكون عمليات التحسين ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة سامسونج للعلوم والتكنولوجيا (مشروع رقم SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
