Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

La traducción en sistemas eucariotas se produce predominantemente a través de vías dependientes de la tapa de 7-metilguanosina (m⁷G)¹. Los estudios indican que el paso de iniciación de la traducción eucariota es la limitación de tipos y un objetivo común para la^{reglamentación 2,3,4}. Los mecanismos de traducción dependiente de la tapa se han estudiado ampliamente utilizando enfoques genéticos^5,bioquímicos^6,7,8,estructurales⁹y genómicos a^granel. Aunque estos métodos han identificado diversos mecanismos que regulan la iniciación dependiente de la tapa, su resolución los limita al ensamble de señales de eventos de iniciación heterogéneos y asincrónicos. Más recientemente, los eventos de traducción in vivo individuales han sido visualizados por métodos que miden la unión de anticuerpos fluorescentes a los epítopos en polipéptidos nacientes^11,12,13,14. Sin embargo, estos nuevos enfoques también están limitados en su capacidad para resolver eventos de iniciación individuales porque múltiples anticuerpos fluorescentes deben unir un péptido naciente para permitir que los eventos de traducción única se resuelvan a partir de un alto fondo de fluorescencia intracelular. En muchas interacciones biológicas, los eventos cinéticos individuales resueltos han proporcionado información crítica sobre la comprensión de procesos biológicos complejos multipaso y repetitivos que no son posibles sincronizar a nivel molecular. Se necesitan nuevos métodos que puedan realizar un seguimiento de la dinámica de los eventos de traducción individuales para una mejor comprensión de la iniciación y la regulación dependientes de la limitación.

Recientemente desarrollamos un ensayo in vitro que mide la cinética de iniciación dependiente de la tapa con resolución de una sola molécula^15. Teniendo en cuenta el gran número de factores proteicos conocidos y desconocidos implicados en esta vía de iniciación^3,16,el ensayo de molécula única fue desarrollado para ser compatible con los sistemas de traducción in vitro existentes libres de células para beneficiarse de su preservación de factores celulares y su sólida actividad de traducción^{17,18,19,20,21,22,23,24,25.} Además, el uso de sistemas de traducción sin células permite comparaciones más compatibles entre observaciones de moléculas únicas y resultados masivos anteriores. Este enfoque proporciona una integración directa de nuevos conocimientos cinéticos de molécula única en el marco mecanicista existente de la iniciación dependiente de la tapa. Para establecer el ensayo de una sola molécula, el sistema de traducción libre de células tradicional se modifica de tres maneras: se inserta una secuencia de codificación de epítopos al principio del marco de lectura abierto (ORF) de un ARNm reportero; el extremo de 3′ del ARNm reportero se biotinila para facilitar el anclaje final del ARNm a la superficie de detección de moléculas únicas; y anticuerpos con etiqueta fluorescente se complementan con el extracto de traducción. Estas modificaciones requieren únicamente técnicas básicas de biología molecular y reactivos comúnmente disponibles. Además, estas modificaciones y las condiciones de imagen de una sola molécula preservan la cinética de traducción de las reacciones de traducción masivas libres de células^15.

En este ensayo(Figura 1),el ARNm de reportero biotinilado de 5’end tapado y 3′-end se inmoviliza a una superficie de detección recubierta de estreptavidina en una cámara de flujo. La cámara de flujo se llena con una mezcla de traducción libre de células complementada con anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Después de que la traducción del ARNM se ha producido durante aproximadamente 30-40 codón aguas abajo de la secuencia de epítopos^26,27,el epítopo emerge del túnel de salida ribosoma y se vuelve accesible para interactuar con anticuerpos con etiqueta fluorescente. Esta interacción es rápida y su detección mediante técnicas de imágenes de fluorescencia de una sola molécula permite el seguimiento de la cinética de traducción con resolución de una sola molécula durante la traducción activa sin células. Este ensayo debe beneficiar ampliamente los estudios in vitro de la cinética de traducción dependiente de la tapa y su regulación, particularmente para sistemas con un ensayo in vitro a granel de trabajo.

Un requisito previo para establecer este ensayo de molécula única es un ensayo de traducción a granel sin células de trabajo, que se puede lograr utilizando extracto de traducción que está disponible comercialmente o preparado siguiendo los métodos descritos anteriormente²⁸. Extracto de traducción eucariota se puede obtener de diversas células, incluyendo hongo, mamífero, y planta^28. Para la toma de imágenes, este ensayo requiere un microscopio TIRF equipado con intensidad láser ajustable y ángulo de incidente, una etapa de muestra motorizada, un sistema de fluidos motorizados y un dispositivo de control de temperatura de la muestra. Estos requisitos son genéricos para los experimentos tirf in vitro modernos de una sola molécula y pueden lograrse de manera diferente. El experimento presentado aquí utiliza un sistema TIRF de tipo objetivo compuesto por microscopio, software y accesorios disponibles comercialmente, todos enumerados en la Tabla de Materiales.