In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики
Summary
Отслеживание отдельных событий перевода позволяет проводить кинетические исследования механизмов перевода с высоким разрешением. Здесь мы демонстрируем одномекулярный анализ in vitro, основанный на взаимодействии изображений между флуоресцентно помеченными антителами и эпитопными зарождающимися пептидами. Этот метод позволяет одномекулярной характеристики инициации и пептидной кинетики удлинения во время активного в пробирке крышка-зависимый перевод.
Abstract
Синтез белка, зависящий от крышки, является преобладающим переводом в эукариотических клетках. Хотя различные биохимические и генетические подходы позволили проведить обширные исследования зависящего от ограничения перевода и его регулирования, кинетической характеристики этого пути перевода с высоким разрешением по-прежнему не хватает. Недавно мы разработали анализ in vitro для измерения кинетической системы перевода, зависящей от колпачка, с разрешением одной молекулы. Анализ основан на флуоресцентно помечены антитела связывания с зарождающейся эпитоп-тегами полипептида. Путем изображения связывания и диссоциации антител к зарождающимся пептидно-рибосомно-мРНК комплексов и из них можно отслеживать прогрессию перевода на отдельных мРНК. Здесь мы представляем протокол для установления этого анализа, включая подготовку мРНК и PEGylated слайдов, визуализацию перевода в режиме реального времени и анализ траекторий одной молекулы. Этот анализ позволяет отслеживать отдельные события перевода, зависящие от ограничения, и решает ключевые кинетики перевода, такие как инициация и удлинение ставок. Анализ может быть широко применен к отдельным системам перевода и должен в целом принести пользу в пробирке исследований зависит от ограничения перевода кинетики и переводческих механизмов контроля.
Introduction
Перевод в эукариотических системах происходит преимущественно через 7-метилгуанозин(м 7G) крышка-зависимых путей1. Исследования показывают, что инициационный шаг эукариотического перевода является ограничением скорости и общей цельюдля регулирования 2,3,4. Механизмы капремонтозависимых переводов были широко изучены с использованиемгенетических 5,биохимических 6,7,8, структурных9игеномных 10 навалочных подходов. Хотя эти методы выявили различные механизмы, которые регулируют ограничения зависимых инициации, их разрешение ограничивает их ансамбль усреднение сигналов от неоднородных и асинхронных событий посвящения. Совсем недавно, отдельные события перевода in vivo были визуализированы методами, которые измеряют флуоресцентные антитела, связывающиеся с эпитопами на зарождающихсяполипептидах 11,12,13,14. Тем не менее, эти новые подходы также ограничены в их способности решать отдельные события посвящения, потому что множественные флуоресцентные антитела должны связывать зарождающийся пептид, чтобы отдельные события перевода были решены из высокого внутриклеточного фона флуоресценции. Во многих биологических взаимодействиях, решенные отдельные кинетические события предоставили критические идеи в понимании сложных многоступенчатых и повторяющихся биологических процессов, которые невозможно синхронизировать на молекулярном уровне. Необходимы новые методы, которые могут отслеживать динамику отдельных событий перевода для лучшего понимания ограничения зависимости от инициации и регулирования.
Недавно мы разработали анализ in vitro, который измеряет зависящая от крышки инициация кинетики с одномекулярнойразрешением 15. Учитывая большое количество известных и неизвестных белковых факторов, участвующихв этом пути инициации 3,16, одномекулярный анализ был разработан, чтобы быть совместимым с существующими системами перевода без клеток in vitro, чтобы извлечь выгоду из их сохранения клеточных факторов инадежной переводческой активности 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Кроме того, использование систем перевода без клеток позволяет проводить более совместимые сопоставления между одномекулярными наблюдениями и предыдущими результатами. Этот подход обеспечивает прямую интеграцию новых одномекулярных кинетических идей в существующие механистические рамки ограничения зависимой инициации. Для установления одномекулярного анализа традиционная система перевода без клеток модифицировалась тремя способами: в начале открытого считывочного кадра (ORF) репортер mRNA вставляется последовательность кодирования эпитопа; 3 “конец репортер мРНК биотинилированных для облегчения мРНК конца привязывая к одной молекулы обнаружения поверхности; и флуоресцентно помеченные антитела дополняются экстрактом перевода. Эти модификации требуют только основных методов молекулярной биологии и общедоступных реагентов. Кроме того, эти модификации и условия одномекулярной визуализации сохраняют кинетику перевода реакций перевода без навалочныхклеток 15.
В этом анализе (Рисунок 1), 5 “конец ограничен и 3”-конец биотинилированных репортер мРНК обездвижены на стрептавидин покрытием обнаружения поверхности в камере потока. Затем камера потока заполняется безклеточной переводной смесью, дополненной флуоресцентно помеченными антителами. После перевода мРНК произошло около 30-40 кодонов вниз потечению эпитопной последовательности 26,27, эпитоп выходит из рибосомного туннеля выхода и становится доступным для взаимодействия с флуоресцентно помеченными антителами. Это взаимодействие происходит быстро, и его обнаружение с помощью одномекулярных методов визуализации флуоресценции позволяет отслеживать перевод кинетики с одномекулярной разрешением во время активного перевода без клеток. Этот анализ должен в целом принести пользу в пробирке исследований кап-зависимых перевод кинетики и ее регулирования, особенно для систем с рабочей массой in vitro анализа.
Предпосылкой для создания этого одномекулярного анализа является рабочая навалом без клеток перевод анализа, который может быть достигнут с помощью перевода экстракт, который является либо коммерчески доступным или подготовлены следующие ранее описанныеметоды 28. Эукариотический перевод экстракт может быть получен из различных клеток, в том числе грибковых, млекопитающих ирастений 28. Для визуализации для этого анализа требуется микроскоп TIRF, оснащенный настраиваемой лазерной интенсивностью и углом инцидента, моторизованной стадией образца, моторизованной системой жидкости и устройством контроля температуры образца. Такие требования являются общими для современных одноямператекулярных экспериментов TIRF in vitro и могут быть достигнуты по-разному. Эксперимент, представленный здесь, использует объективную систему TIRF, состоит из коммерчески доступных микроскопов, программного обеспечения и аксессуаров, перечисленных в таблице материалов.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с типичными в пробирке TIRF одномекулярных экспериментов, одноямекулярная визуализация с анализом, описанным здесь, дополнительно сложна из-за использования клеточного экстракта и высокой концентрации флуоресцентно помеченных антител. По сравнению с более распростр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01GM121847); Мемориальный онкологический центр Слоан Кеттеринг (MSKCC) Грант/Основной Грант (P30 CA008748); и Инициатива MSKCC по функциональной геномике.
Materials
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
References
- Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
- Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
- Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
- Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
- Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
- Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
- Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5′ cap, and 3′ poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
- Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
- Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
- Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5′ and 3′ ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
- Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
- Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
- Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
- Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
- Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
- Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
- Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
- Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
- Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
- Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
- White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
- Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
- Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
- Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).
