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Biochemistry

Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Published: September 15, 2020
doi:
10.3791/61648
, ,
1Molecular Biology Program,Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

O rastreamento de eventos de tradução individual permite estudos cinéticos de alta resolução de mecanismos de tradução dependentes de tampas. Aqui demonstramos um ensaio in vitro de molécula única baseado em interações de imagem entre anticorpos fluorescentes rotulados e peptídeos nascentes marcados por epítope. Este método permite a caracterização de uma molécula de cinética de iniciação e alongamento de peptídeos durante a tradução ativa in vitro dependente de tampas.

Abstract

A síntese proteica dependente da tampa é o caminho de tradução predominante em células eucarióticas. Embora várias abordagens bioquímicas e genéticas tenham permitido estudos extensivos de tradução dependente de tampas e sua regulação, ainda falta caracterização cinética de alta resolução dessa via de tradução. Recentemente, desenvolvemos um ensaio in vitro para medir cinética de tradução dependente da tampa com resolução de molécula única. O ensaio é baseado em anticorpos fluorescentes rotulados para polipeptídeo marcado por epítope nascente. Ao imaginar a vinculação e dissociação de anticorpos de e para os complexos de peptídeos nascentes-ribossome-mRNA, a progressão de tradução em mRNAs individuais pode ser rastreada. Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer este ensaio, incluindo preparações de slides mRNA e PEGylated, imagens em tempo real de tradução e análise de trajetórias de moléculas únicas. Este ensaio permite o rastreamento de eventos de tradução individuais dependentes de tampas e resolve cinéticas de tradução chave, como taxas de iniciação e alongamento. O ensaio pode ser amplamente aplicado a sistemas de tradução distintos e deve beneficiar amplamente estudos in vitro de cinética de tradução dependente de tampa e mecanismos de controle translacional.

Introduction

A tradução em sistemas eucarióticos ocorre predominantemente através de 7-metilguanosina (m7G) caminhos dependentes de tampa1. Estudos indicam que a etapa de iniciação da tradução eucariótica é limitante e uma meta comum para a regulação2,3,4. Os mecanismos de tradução dependente de tampa têm sido extensivamente estudados utilizando abordagens genéticas5, bioquímicas6,7,8, estrutura9e genômica de10 a granel. Embora esses métodos tenham identificado diversos mecanismos que regulam a iniciação dependente de tampas, sua resolução os limita a apresentar a média de sinais de eventos de iniciação heterogênea e assíncrono. Mais recentemente, eventos individuais de tradução in vivo foram visualizados por métodos que medem a ligação de anticorpos fluorescentes a epítopes em polipeptídeos nascentes11,12,13,14. No entanto, essas novas abordagens também são limitadas em sua capacidade de resolver eventos de iniciação individual, porque vários anticorpos fluorescentes devem ligar um peptídeo nascente para permitir que eventos de tradução única sejam resolvidos a partir de um fundo de fluorescência intracelular elevado. Em muitas interações biológicas, eventos cinéticos individuais resolvidos forneceram insights críticos sobre a compreensão de processos biológicos complexos e repetitivos que não são possíveis de sincronizar a nível molecular. Novos métodos que podem acompanhar a dinâmica dos eventos de tradução individual são necessários para uma melhor compreensão da iniciação e regulação dependentes do limite.

Recentemente desenvolvemos um ensaio in vitro que mede cinética de iniciação dependente da tampa com resolução de molécula única15. Considerando o grande número de fatores proteicos conhecidos e desconhecidos envolvidos nesta via de iniciação3,16, o ensaio de molécula única foi desenvolvido para ser compatível com sistemas de tradução in vitro sem células existentes para se beneficiar da preservação de fatores celulares e atividade de tradução robusta17,18,19,20,21,22,23,24,25. Além disso, o uso de sistemas de tradução sem células permite comparações mais compatíveis entre observações de molécula única e resultados em massa anteriores. Essa abordagem fornece uma integração direta de novas percepções cinéticas de molécula única sobre a estrutura mecanicista existente da iniciação dependente da tampa. Para estabelecer o ensaio de molécula única, o sistema tradicional de tradução livre de células é modificado de três maneiras: uma sequência de codificação de epítopes é inserida no início do quadro de leitura aberta (ORF) de um repórter mRNA; o final de 3′ do repórter mRNA é biotinilado para facilitar o end-tethering mRNA para a superfície de detecção de molécula única; e anticorpos fluorescentes são complementados ao extrato de tradução. Essas modificações requerem apenas técnicas básicas de biologia molecular e reagentes comumente disponíveis. Além disso, essas modificações e as condições de imagem de molécula única preservam a cinética de tradução das reações de tradução sem células a granel15.

Neste ensaio (Figura 1), 5′-end tampado e 3′-end repórter biotinilado mRNA é imobilizado para uma superfície de detecção revestida de streptavidin em uma câmara de fluxo. A câmara de fluxo é então preenchida com uma mistura de tradução livre de células complementada com anticorpos fluorescentes rotulados. Após a tradução mRNA ter ocorrido para aproximadamente 30-40 códons a jusante da sequência de epítope26,27, o epítope emerge do túnel de saída ribossomo e torna-se acessível para interagir com anticorpos fluorescentes rotulados. Essa interação é rápida e sua detecção por técnicas de imagem de fluorescência de molécula única permite o rastreamento de cinéticas de tradução com resolução de molécula única durante a tradução ativa livre de células. Este ensaio deve beneficiar amplamente estudos in vitro de cinética de tradução dependente de tampa e sua regulação, particularmente para sistemas com um ensaio in vitro em massa funcionando.

Um pré-requisito para estabelecer este ensaio de molécula única é um ensaio de tradução livre de células em massa, que pode ser alcançado usando extrato de tradução que esteja comercialmente disponível ou preparado seguindo os métodos descritos anteriormente28. O extrato de tradução eucariótica pode ser obtido de diversas células, incluindo fungos, mamíferos e plantas28. Para imagens, este ensaio requer um microscópio TIRF equipado com intensidade laser e ângulo incidente, um estágio de amostra motorizado, um sistema fluido motorizado e dispositivo de controle de temperatura da amostra. Tais requisitos são genéricos para experimentos modernos in vitro de tirf de molécula única e podem ser alcançados de forma diferente. O experimento aqui apresentado utiliza um sistema TIRF de tipo objetivo composto por microscópio, software e acessórios disponíveis comercialmente, todos listados na Tabela de Materiais.

Protocol

1. Geração de repórter mRNA Modifique um modelo de transcrição de DNA que codifica um mRNA repórter “não grampeado” de ensaio em massa inserindo uma sequência de codificação de tags de epitope N-terminus para gerar um modelo de transcrição de DNA para um mRNA repórter “marcado”(Figura 2A).NOTA: Recomenda-se interação 3xFLAG/antiflag para este ensaio devido à sua sensibilidade superior e ao curto comprimento da tag 3xFLAG. No entanto, o ensaio é compatível com …

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito permite a imagem de interações individuais de anticorpos com polipeptídeos com marca de n-terminal com resolução de molécula única durante a tradução ativa livre de células do repórter mRNA(Figura 1). Um experimento mínimo de demonstração é relatado com o uso de três mRNAs sintéticas: LUC (codificação de luciferase não grampeada), BANDEIRA LUC(codificação de luciferase marcada por 3xFLAG) e hp-…

Discussion

Em comparação com os típicos experimentos de tirf de molécula única in vitro, a imagem de molécula única com o ensaio descrito aqui é adicionalmente complexa devido ao uso de extrato celular e a uma alta concentração de anticorpos fluorescentes rotulados. Em comparação com a prática mais comum de uma rodada de PEGylation de superfície, uma segunda rodada de PEGylation (passo 2) reduz consideravelmente a ligação de anticorpos inespecíficos à superfície de detecção15. A…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R01GM121847]; o Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); e iniciativa de genômica funcional MSKCC.

Materials

100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004
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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).
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