キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

真核生物系における翻訳は、主に7-メチルグアノシン^(m7G)キャップ依存経路¹を介して起こる。研究は、真核生物翻訳の開始段階がレート制限であり^{、規則2、3、4}の共通の目標であることを示している。キャップ依存性翻訳のメカニズムは、遺伝的^5、生化学的^6、7、8、構造^9、およびゲノム¹⁰バルクアプローチを用いて広範囲に研究されてきた。これらの方法は、キャップ依存の開始を制御する多様なメカニズムを特定しましたが、その解決は、異種および非同期開始イベントからの信号のアンサンブル平均に制限されます。さらに最近では、生体内翻訳イベントの個々の可視化は、新生ポリペプチド11、12、13、14上のエピトープに結合する蛍光抗体を測定する方法によって可視化されている。しかし、これらの新しいアプローチは、複数の蛍光抗体が新生ペプチドに結合して、単一の翻訳事象を高細胞内蛍光のバックグラウンドから解決できるようにするために、個々の開始事象を解決する能力にも限界があります。多くの生物学的相互作用において、解決された個々の運動事象は、分子レベルで同期することができない複雑な多段階および反復的な生物学的プロセスを理解するための重要な洞察を提供してきた。キャップ依存の開始と規制をより深く理解するためには、個々の翻訳イベントのダイナミクスを追跡できる新しい方法が必要です。

我々は最近、単一分子分解能¹⁵を有するキャップ依存性開始運動を測定するインビトロアッセイを開発した。この開始経路^3,16に関与する既知および未知のタンパク因子の多数を考慮すると、単一分子アッセイは、細胞因子および堅牢な翻訳活性17、18、19、20、21、22、23、24、25の保存の恩恵を受けるために^、既存のインビトロ無細胞翻訳系と互換性があるように開発された。さらに、無細胞翻訳システムを使用することで、単一分子観測と以前のバルク結果との比較がより互換性があります。このアプローチは、キャップ依存開始の既存の機械化フレームワークに新しい単一分子運動学的洞察を簡単に統合することを提供する。単一分子アッセイを確立するために、従来の無細胞翻訳システムは3つの方法で修飾されます:エピトープコード配列はレポーターmRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)の最初に挿入されます。レポーターmRNAの3′末端は、単一分子検出表面へのmRNA末端テザリングを容易にするためにビオチン化される。蛍光標識抗体は翻訳抽出物に補足されます。これらの修飾は、基本的な分子生物学の技術と一般的に入手可能な試薬のみを必要とします。さらに、これらの改変および単一分子イメージング条件は、バルク無細胞翻訳反応¹⁵の翻訳動態を維持する。

このアッセイ(図1)において、5′末端キャップおよび3′末端ビオチン化レポーターmRNAは、流れチャンバ内のストレプトアビジン被覆検出面に固定化される。流れチャンバは、次いで蛍光標識抗体を補充した無細胞翻訳混合物で満たされる。エピトープ配列^26,27の下流にある約30~40コドンに対するmRNA翻訳が行われた後^、エピトープはリボソーム出口トンネルから出現し、蛍光標識抗体と相互作用するようになります。この相互作用は迅速であり、単一分子蛍光イメージング技術による検出により、活性無細胞翻訳中の単一分子分解能による翻訳キネティックスの追跡が可能になります。このアッセイは、キャップ依存翻訳キネティクスとその規制、特に働くバルクインビトロアッセイを有するシステムに関するインビトロ研究に大きく利益をもたらすべきである。

この単一分子アッセイを確立するための前提条件は、働くバルク無細胞翻訳アッセイであり、市販または前に述べた方法²⁸に記載された翻訳抽出物を使用して達成することができる。真核生物翻訳抽出物は、真菌、哺乳類、および植物²⁸を含む多様な細胞から得ることができる。イメージングのために、このアッセイは、調整可能なレーザー強度と入射角度、電動サンプルステージ、電動流体システム、およびサンプル温度制御装置を備えたTIRF顕微鏡を必要とします。このような要件は、現代 のインビトロ 単一分子TIRF実験に対して一般的であり、異なる方法で達成され得る。ここで紹介する実験では、市販の顕微鏡、ソフトウェア、および付属品から構成される客観的なタイプのTIRFシステムを使用して、すべての 材料表に記載されています。