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Biochemistry

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Published: September 15, 2020
doi:
10.3791/61648
, ,
1Molecular Biology Program,Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Abstract

Die cap-abhängige Proteinsynthese ist der vorherrschende Translationsweg in eukaryotischen Zellen. Während verschiedene biochemische und genetische Ansätze umfangreiche Studien über die kapabhängige Übersetzung und ihre Regulierung ermöglicht haben, fehlt es noch immer an einer hochauflösenden kinetischen Charakterisierung dieses Übersetzungswegs. Kürzlich haben wir einen In-vitro-Assay entwickelt, um die capabhängige Translationskinetik mit Einzelmolekülauflösung zu messen. Der Test basiert auf fluoreszierend gekennzeichneten Antikörperbindungen an entstehendes Epitop-markiertes Polypeptid. Durch die Abbildung der Bindung und Dissoziation von Antikörpern an und von entstehenden Peptid-Ribosome-mRNA-Komplexen kann die Translationsprogression auf einzelnen mRNAs nachverfolgt werden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung dieses Assays vor, einschließlich mRNA- und PEGylated-Diapräparate, Echtzeit-Bildgebung der Translation und Analyse einzelner Molekülbahnen. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung einzelner capabhängiger Übersetzungsereignisse und löst wichtige Translationskinetik, wie Initiierungs- und Dehnungsraten. Der Assay kann in großem Umfang auf unterschiedliche Übersetzungssysteme angewendet werden und sollte im Großen und Ganzen In-vitro-Studien über capabhängige Translationskinetik und translationale Kontrollmechanismen profitieren.

Introduction

Die Übersetzung in eukaryotischen Systemen erfolgt überwiegend über 7-Methylguanosin (m7G) kappenabhängige Wege1. Studien zeigen, dass der Initiationsschritt der eukaryotischen Übersetzung die Rate begrenzend ist und ein gemeinsames Ziel für regulation2,3,4ist. Mechanismen der kappenabhängigen Übersetzung wurden ausgiebig mit genetischen5, biochemischen6,7,8, strukturellen9und genomischen10 Massenansätzen untersucht. Obwohl diese Methoden verschiedene Mechanismen identifiziert haben, die die capabhängige Initiation regulieren, beschränkt ihre Auflösung sie auf die Ensemble-Mittelung von Signalen aus heterogenen und asynchronen Initiationsereignissen. In jüngerer Zeit wurden einzelne In-vivo-Translationsereignisse mit Methoden visualisiert, die die fluoreszierende Antikörperbindung an Epitope auf aufkeimenden Polypeptiden11,12,13,14messen. Diese neuen Ansätze sind jedoch auch in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, einzelne Initiationsereignisse zu lösen, da mehrere fluoreszierende Antikörper ein aufkeimendes Peptid binden müssen, damit einzelne Translationsereignisse aus einem hohen intrazellulären Fluoreszenzhintergrund gelöst werden können. In vielen biologischen Wechselwirkungen haben gelöste einzelne kinetische Ereignisse kritische Einblicke in das Verständnis komplexer mehrstufiger und sich wiederholender biologischer Prozesse geliefert, die auf molekularer Ebene nicht synchronisiert werden können. Neue Methoden, die die Dynamik einzelner Übersetzungsereignisse nachverfolgen können, sind für ein besseres Verständnis der cap-abhängigen Initiierung und Regulierung erforderlich.

Kürzlich haben wir einen In-vitro-Test entwickelt, der die cap-abhängige Initiationskinetik mit der Einmolekülauflösung15misst. Unter Berücksichtigung der großen Anzahl bekannter und unbekannter Proteinfaktoren, die an diesem Initiationsweg beteiligt sind3,16, wurde der Einzelmolekül-Assay entwickelt, um mit bestehenden in vitro zellfreien Übersetzungssystemen kompatibel zu sein, um von ihrer Erhaltung zellulärer Faktoren und robuster Translationsaktivität17,18,19,20,21,22,23,24,25zu profitieren. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz zellfreier Übersetzungssysteme kompatiblere Vergleiche zwischen Einzelmolekülbeobachtungen und früheren Massenergebnissen. Dieser Ansatz ermöglicht eine geradlinige Integration neuer kinetischer Einzelmoleküleinblicke in den bestehenden mechanistischen Rahmen der kappenabhängigen Initiation. Um den Einzelmolekül-Assay zu etablieren, wird das traditionelle zellfreie Übersetzungssystem auf drei Arten modifiziert: Zu Beginn des offenen Leserahmens (ORF) eines Reporters mRNA wird eine epitopkodiende Sequenz eingefügt; das 3-Zoll-Ende der Reporter-mRNA ist biotinyliert, um mRNA-End-Tethering-zu-Einmolekül-Detektionsfläche zu erleichtern; und fluoreszierend gekennzeichnete Antikörper werden zum Translationsextrakt ergänzt. Diese Modifikationen erfordern nur grundlegende molekularbiologische Techniken und allgemein verfügbare Reagenzien. Darüber hinaus bewahren diese Modifikationen und die einmolekularen Bildbedingungen die Translationskinetik von massenzellfreien Translationsreaktionen15.

In diesem Test (Abbildung 1), 5′-End-gekapselter und 3′-End-biotinylierter Reporter mRNA wird zu einer Streptavidin-beschichteten Detektionsfläche in einer Strömungskammer immobilisiert. Die Durchflusskammer wird dann mit einem zellfreien Translationsgemisch gefüllt, das mit fluoreszierend gekennzeichneten Antikörpern ergänzt wird. Nachdem die mRNA-Translation für ca. 30-40 Codons unterhalb der Epitopsequenz26,27erfolgt ist, entsteht das Epitop aus dem Ribosom-Ausgangstunnel und wird zugänglich, um mit fluoreszierend markierten Antikörpern zu interagieren. Diese Wechselwirkung ist schnell und ihre Detektion durch einzelmolekulare Fluoreszenz-Bildgebungstechniken ermöglicht die Verfolgung der Translationskinetik mit Einzelmolekülauflösung während der aktiven zellfreien Translation. Dieser Test sollte im Großen und Ganzen In-vitro-Studien zur kapabhängigen Translationskinetik und ihrer Regulierung zugute kommen, insbesondere für Systeme mit einem in vitro-basierten Massentest.

Eine Voraussetzung für die Etablierung dieses einzelmolekularen Assays ist ein massengangfreies Translations-Assay, das mit einem Übersetzungsextrakt erreicht werden kann, der entweder kommerziell erhältlich ist oder nach zuvor beschriebenen Methoden28hergestellt wird. Eukaryotische Translation Extrakt kann aus verschiedenen Zellen gewonnen werden, einschließlich Pilz, Säugetier, und Pflanze28. Für die Bildgebung benötigt dieser Test ein TIRF-Mikroskop mit einstellbarer Laserintensität und Einfallswinkel, eine motorisierte Probenstufe, ein motorisiertes Fluidiksystem und ein Probentemperaturregelgerät. Solche Anforderungen sind generisch für moderne In-vitro-Einzelmolekül-TIRF-Experimente und können unterschiedlich erreicht werden. Das hier vorgestellte Experiment verwendet ein objektives TIRF-System, das aus handelsüblichen Mikroskopen, Software und Zubehör besteht, die alle in der Tabelle der Materialienaufgeführt sind.

Protocol

1. Generierung von Reporter mRNA Ändern Sie eine DNA-Transkriptionsvorlage, die einen “unmarkierten” Reporter mRNA mit Massentest kodiert, indem Sie eine N-terminus-Epitop-Tag-Codierungssequenz einfügen, um eine DNA-Transkriptionsvorlage für einen “markierten” Reporter mRNA zu generieren (Abbildung 2A).HINWEIS: Für diesen Test wird aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und der kurzen 3xFLAG-Tag-Länge eine 3xFLAG/Anti-FLAG-Interaktion empfohlen. Der Assay ist jedoch …

Representative Results

Das Folgende beschriebene Protokoll ermöglicht die Abbildung einzelner Antikörper-Wechselwirkungen mit entstehenden N-terminal-markierten Polypeptiden mit einzelmolekularer Auflösung während der aktiven zellfreien Translation von 3′ End-tethered Reporter mRNA (Abbildung 1). Ein minimales Demonstrationsexperiment wird mit der Verwendung von drei synthetischen mRNAs berichtet: LUC (Codierung nicht markiert luziferase), LUCFLAG (Codierung 3xFLAG-getaggt…

Discussion

Im Vergleich zu typischen in vitro TIRF Einzelmolekülexperimenten ist die hier beschriebene Einzelmolekül-Bildgebung mit dem hier beschriebenen Assay durch den Einsatz von Zellextrakt und einer hohen Konzentration fluoreszierend markierter Antikörper zusätzlich komplex. Im Vergleich zur gebräuchlicheren Praxis einer Flächen-PEGylation reduziert eine zweite Runde PEGylation (Schritt 2) die unspezifische Antikörperbindung an die Nachweisfläche15erheblich. Die hohe Konzentration diff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01GM121847] unterstützt; das Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); und msKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004
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References

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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).
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