Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

La traduction dans les systèmes eucaryotes se fait principalement par des voies dépendantes du capuchon 7-méthylguanosine (m⁷G)¹. Des études indiquent que l’étape d’initiation de la traduction eucaryotique limite les taux et est une cible commune pour^{la réglementation 2,3,4}. Les mécanismes de traduction dépendant du cap ont été largement étudiés à l’aide^{d’approches génétiques 5,}biochimiques^{6,7,8,structurelles 9}et^{génomiques 10} en vrac. Bien que ces méthodes aient identifié divers mécanismes qui régulent l’initiation dépendante du cap, leur résolution les limite à la moyenne des signaux provenant d’événements d’initiation hétérogènes et asynchrones. Plus récemment, des événements individuels de traduction in vivo ont été visualisés par des méthodes qui mesurent la liaison fluorescente d’anticorps aux épitopes sur les polypeptides naissants^11,12,13,14. Cependant, ces nouvelles approches sont également limitées dans leur capacité à résoudre les événements d’initiation individuels parce que les anticorps fluorescents multiples doivent lier un peptide naissant pour permettre aux événements de traduction simples d’être résolus à partir d’un fond élevé de fluorescence intracellulaire. Dans de nombreuses interactions biologiques, les événements cinétiques individuels résolus ont fourni des aperçus critiques dans la compréhension de processus biologiques complexes en plusieurs étapes et répétitifs qui ne sont pas possibles de se synchroniser au niveau moléculaire. De nouvelles méthodes qui peuvent suivre la dynamique des événements de traduction individuels sont nécessaires pour mieux comprendre l’initiation et la réglementation dépendantes du plafond.

Nous avons récemment développé un test in vitro qui mesure la cinétique d’initiation dépendante du capuchon avec résolution à molécule unique¹⁵. Compte tenu du grand nombre de facteurs protéiques connus et inconnus impliqués dans cette voie d’initiation^3,16, l’analyse d’une seule molécule a été développée pour être compatible avec les systèmes de traduction in vitro sans cellules pour bénéficier de leur préservation des facteurs cellulaires et de l’activité de traduction^{robuste 17,18,19,20,21,22,23,24,25}. En outre, l’utilisation de systèmes de traduction sans cellules permet des comparaisons plus compatibles entre les observations à molécule unique et les résultats en vrac antérieurs. Cette approche fournit une intégration simple de nouvelles idées cinétiques à molécule unique dans le cadre mécaniste existant de l’initiation dépendante du capuchon. Pour établir l’analyse à molécule unique, le système de traduction traditionnel sans cellules est modifié de trois façons : une séquence d’encodage d’épitope est insérée au début du cadre de lecture ouvert (ORF) d’un armature de reporter; l’extrémité 3′ de l’ARNm reporter est biotinylée pour faciliter l’attache de l’ARNm à la surface de détection d’une seule molécule; et les anticorps étiquetés fluorescents sont complétés à l’extrait de traduction. Ces modifications ne nécessitent que des techniques de biologie moléculaire de base et des reagents couramment disponibles. En outre, ces modifications et les conditions d’imagerie à molécule unique préservent la cinétique de traduction des réactions de traduction sans cellules en^{vrac 15}.

Dans cet essai (Figure 1), 5′-end plafonné et 3′end biotinylated reporter ARNm est immobilisé à une surface de détection enduite de streptavidine dans une chambre d’écoulement. La chambre d’écoulement est ensuite remplie d’un mélange de traduction sans cellules complété par des anticorps étiquetés fluorescents. Après la traduction de l’ARNm a eu lieu pour environ 30-40 codons en aval de la séquence épitopique^26,27, l’épitope émerge du tunnel de sortie ribosome et devient accessible pour interagir avec des anticorps fluorescents étiquetés. Cette interaction est rapide et sa détection par des techniques d’imagerie par fluorescence à molécule unique permet le suivi de la cinétique de traduction avec résolution d’une molécule unique lors de la traduction active sans cellules. Cet essai devrait largement bénéficier d’études in vitro de la cinétique de traduction dépendante du capuchon et de sa régulation, en particulier pour les systèmes avec un essai in vitro en vrac de travail.

Une condition préalable à l’établissement de cet essai à molécule unique est un essai de traduction en vrac sans cellules, qui peut être réalisé à l’aide d’extrait de traduction qui est disponible sur le marché ou préparé selon les méthodes décrites^{précédemment 28}. Extrait de traduction eucaryotique peut être obtenu à partir de diverses cellules, y compris fongique, mammifère, et la^{plante 28}. Pour l’imagerie, cet essai nécessite un microscope TIRF équipé de l’intensité laser tunable et l’angle d’incident, un stade d’échantillon motorisé, un système fluidique motorisé, et dispositif de contrôle de la température de l’échantillon. Ces exigences sont génériques pour les expériences modernes de TIRF à molécule unique in vitro et peuvent être réalisées différemment. L’expérience présentée ici utilise un système TIRF de type objectif composé de microscopes, de logiciels et d’accessoires disponibles dans le commerce, tous énumérés dans le Tableau des matériaux.