JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

Published: July 09, 2020
doi:
10.3791/61623
, ,
1Cell Biology and Anatomy, Chicago Medical School,Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Center for Brain Function and Repair,Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Bu protokol, transgenik olmayan omurgasız türlerde, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve bir fotodiyot dizisi kullanılarak nöronal popülasyon aktivitesini tek hücreli çözünürlükle görüntüleme için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, görüntüleme ve analizin tek bir gün boyunca takip edilebildiği hızlı bir iş akışı sağlar.

Abstract

Belirtilebilir nöron setlerinin aktivitesinin ışıkla kaydedilebileceği ve manipüle edilebildiği transgenik omurgasız preparatların geliştirilmesi, davranışın sinirsel temelinin çalışmaları için devrimci bir ilerlemeyi temsil eder. Bununla birlikte, bu gelişmenin bir dezavantajı, araştırmacıları çok az sayıda “tasarımcı” organizmaya (örneğin, C. elegans ve Drosophila)odaklama eğilimidir ve ağ işlevinin genel ilkelerini tanımlamak için gerekli olan birçok türdeki karşılaştırmalı çalışmaların takibini olumsuz yönde etkileme potansiyeline sahiptir. Bu makale, transgenik olmayan gastropod türlerinin beyinlerinde voltaja duyarlı boyalarla optik kaydın, sinir ağlarının tek hücreli çözünürlükle işlevsel organizasyonunun özelliklerini hızlı bir şekilde (yani tek deneyler sırasında) nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Laboratuvarımız tarafından birden fazla gastropod türünün CNS’sinde davranışsal olarak ilgili motor programlar sırasında düzinelerce ila ~ 150 nörondan eylem potansiyeli izleri elde etmek için kullanılan diseksiyon, boyama ve kayıt yöntemlerini ayrıntılı olarak özetliyoruz, nörobilime yeni bir tane de dahil olmak üzere – nudibranch Berghia stephanieae. Görüntüleme, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve kaydedilen nöronlar tarafından üretilen tüm eylem potansiyellerini yakalayacak kadar hızlı, saniyede 1.600 karede örneklenen 464 elemanlı fotodiyot dizisi ile gerçekleştirilir. Hazırlık başına çok az veya hiç sinyal ağartma veya fototoksiklik olmadan birden fazla birkaç dakikalık kayıt elde edilebilir. Açıklanan yöntemlerle toplanan ham optik veriler daha sonra çeşitli resimli yöntemlerle analiz edilebilir. Optik kayıt yaklaşımımız, çeşitli transgenik olmayan türlerdeki ağ aktivitesini araştırmak için kolayca kullanılabilir, bu da beyinlerin davranışı nasıl ürettiğine dair karşılaştırmalı çalışmalar için çok uygundur.

Introduction

Drosophila ve C. elegans gibi omurgasızların transgenik çizgilerinin gelişimi, davranışın sinirsel temellerinin optik olarak sorgulanabileceği ve manipüle edilebileceği güçlü sistemler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu özel preparatlar, özellikle yeni türlerin sinirbilim araştırmalarına girmesiyle ilgili olarak, transgenik olmayan türlerin sinir devresi çalışmalarına olan coşkuyu azaltmanın olumsuz yanına sahip olabilir. Yalnızca bir veya iki model sisteme odaklanmak, ağ işlevinin genel ilkelerinin aranmasına zarar vericidir, çünkü karşılaştırmalı çalışmalar bu ilkelerin keşfedildiği temel bir rotayı temsil eder1,2,3,4. Buradaki amacımız, sinir ağı fonksiyonunun karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştırmak amacıyla gastropod sinir ağlarının fonksiyonel yapısı hakkında hızlı bir fikir edinmek için geniş ölçekli bir görüntüleme yaklaşımı göstermektir.

Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea ve diğerleri gibi gastropod yumuşakçaları uzun zamandır sinir ağı işlevinin ilkelerini araştırmak için kullanılmıştır, çünkü davranışları büyük ölçüde gangliyon yüzeyinde bulunan büyük, genellikle bireysel olarak tanımlanabilir nöronlar tarafından aracılık edilir ve kayıt teknikleri için kolayca erişilebilir hale getirir5.  1970’lerde, plazma zarına entegre olabilecek voltaja duyarlı boyalar (VSD’ler) geliştirildi ve kısa sürede birden fazla nöron tarafından üretilen eylem potansiyellerinin ilk elektrotsuz kayıtlarını sağladı6. Burada, sinirbilime yeni biri olan Berghia stephanieaede dahil olmak üzere çeşitli gastropod türlerindeki ağ aktivitesini incelemek için VSD’leri kullandığımızı gösteriyoruz. Görüntüleme cihazı, 1.600 kare /saniye(Şekil 1)hızında örneklenen ve hızlı emilim VSD’leri ile kullanıldığında, kaydedilen tüm nöronların eylem potansiyellerini ortaya çıkaran ticari olarak kullanılabilen 464 elementli bir fotodiyot dizisidir7. Tüm diyotlar tarafından kaydedilen sinyaller, satın alındıktan hemen sonra görüntülenir ve PDA alım yazılımındaki ganglionun bir görüntüsünün üzerine bindirilir, bu da aynı hazırlıkta keskin elektrotlarla ilgi çekici nöronların araştırılmasını mümkün hale getirir8,9.

Ham PDA verilerinde, birçok diyot büyük nöronları gereksiz olarak kaydeder ve birçoğu birden fazla nörondan karışık sinyaller içerir. Bir dönüm noktası, her ham 464 kanallı PDA veri kümesini, kaydedilen her nöronun yalnızca eylem potansiyellerini içeren ayrı bir izlemede göründüğü yeni bir izleme kümesine hızlı bir şekilde işlemek için bağımsız bileşen analizi kullanarak otomatik bir ani sıralama yönteminin geliştirilmesiydi10,11.

Bu yazıda, fotodiyot dizisi ve hızlı emilim VSD’leri ile gastropod sinir sistemlerinden büyük ölçekli eylem potansiyeli kayıtlarının eldeinde yer alan temel adımları özetliyoruz.  Ayrıca, optik olarak kaydedilmiş nöronların işlevsel topluluklarına göre kümelenmesi ve haritalandırılması ve ateşleme izlerinin basit bir şekilde incelenmesiyle genellikle belirgin olmayan popülasyon düzeyindeki özellikleri karakterize etmek için 12,13.

Protocol

NOT: Aşağıda özetlenen iş akışı Şekil 2’de özetlenmiştir. 1. Titreşimi en aza indirin Mümkünse, makinenin zemin katta olduğundan emin olun ve hava tablolarından daha geniş bir titreşim frekansı aralığını sönümleyen yay tabanlı bir izolasyon masası kullanın. Yay tabanlı bir tablo kullanıyorsanız, kayan olduğundan emin olun (her bir şey ekleniyorsa veya tablodan çıkarılıyorsa ayarlanması gerekir). Gerekirse görüntüleme sırasında hava akışını kapatacak ölçüde bile görüntüleme odasındaki titreşim tabanlı gürültüyü mümkün olduğunca azaltın. Perfüzyon sistemlerinde sıvı türbülansından kaynaklanan titreşimleri en aza indirin.NOT: Sinirsel hazırlık, satın alma sırasında hareket etmemelidir. Her türlü hareket, diyotlar boyunca kontrast kenarlarının kaymalarını üreterek artitsel sinyallere yol açtı. Prosedür satın alma sırasında bir uyaran içeriyorsa, hazırlık hareketini teşvik etmemelidir. 2. Ganglion fotoğraflarının PDA verileriyle uygun hizalanmasını sağlamak için bir iğne deliği testi çalıştırın Mikroskop kaydırağı üzerine 3 küçük delikli bir alüminyum folyo parçası yerleştirin. Parfokal fotoport’una monte edilmiş dijital kamera ile üç deliğin görüntüsünü alın. PDA ile birlikte gelen görüntüleme yazılımını kullanarak kısa bir dosya (ör. 5 sn) haline alın. Satın alma işleminin bir parçası olarak, pim deliklerinin kenarlarında çok görünür olacak titreşim yapıtlarını teşvik etmek için tabloya dokunun ve iğne deliklerinin görüntüsünün optik verilerle tam olarak hizalanabilmesini sağlar. Görüntüleme yazılımında ÜstYükleme işlevini kullanma, menü öğesinde bulunan “| görüntüle Sayfa Üst | Dış Görüntü | Üst Üste Bindirme Görüntüsü,” diyot verilerini iğne deliklerinin fotoğrafına bindirmek ve ardından iğne delikleri diyot verilerindeki iğne deliği yapıtlarının tam üstüne oturana kadar fotoğraf için x, y ve büyütme ayarlarını yinelemeli olarak ayarlayın. Kamerayla çekilen hazırlık görüntülerini gelecekteki deneylerde diyot verileriyle hizalamak için bu sayıları kaydedin.NOT: PDA’nın iğne deliği hizalamasının, PDA mikroskop üzerine monte edildikten sonra, döndürülene veya çıkarılana kadar sadece bir kez yapılması gerekir, bu sırada tekrar yapılmalıdır. 3. Üç deniz gastropod türü için diseksiyonlar Tritonia ve Aplysiagibi büyük boyuta büyüyen türler için, daha ince, daha az opak gangliyonlara sahip daha küçük bireylerle başlayın ve optimum sinyal-gürültü için yeterli ışık elde etmeyi kolaylaştırın. Diseksiyonlar ve görüntüleme deneyleri için tuzlu su olarak kullanılmak üzere hazır filtrelenmiş yapay deniz suyuna sahip olun.NOT: Protokolün sonraki tüm adımlarında “salin” yapay deniz suyunu ifade eder. Tritoni diomedinin diseksiyonu Bir hayvanı uyuşturmak için buzdolabına yaklaşık 20 dakika yerleştirin. Daha büyük hayvanlar için, hayvanı bir elinde tutarak beyni açığa çıkararak, başın ucunun “boynu” ortaya çıkarmak için baş ucunun baş ucunun baş parmağın üzerine örtülmasına izin verin. Daha küçük hayvanlar için, beyni açığa çıkarmadan önce sırtlarını balmumu kaplı bir diseksiyon kabına sabitle. Diseksiyon makası kullanarak, hayvanın dorsal tarafında, bukkal kütlenin üzerinde (vücut duvarından hissedilebilen) 3-4 cm orta çizgi kesiği yapın.NOT: CNS’nin kaynaşmış, bilateral serebropleural ve pedal gangliyonundan oluşan gerekli kısmı turuncudur ve çevre dokudan belirgindir; hemen rinoforların posterior ve bukkal kütlenin üzerinde uzanır. Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, sert ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS’yi genişletin, merkezi gangliyasyonu birbirine bağlayan tüm sinirleri sağlam tutun. Uzun bir pedal siniri 3 (PdN3) veya hangi sinir uyarılacaksa bırakın. Daha fazla diseksiyon için CNS’yi tuzlu su dolu elastomer kaplı bir yemeğin altına yapıştırmak için minutien pimleri kullanın. Peristaltik bir pompa kullanarak geri bildirim kontrollü, sıralı Peltier soğutma sistemi ile verilen salin ile yemeği perfüzyona sokarak hazırlık sıcaklığını 11 °C’de koruyun. Peripler ve mikrodiseksiyon makası kullanarak, bağ dokusunun gevşek yapışkan tabakasını CNS çevresinden dikkatlice çıkarın. İnce kılıfa gangliyona sıkıca bağlı bırak. Kısaca (~10 s) gangliyonu salin içinde% 0.5 glutaraldehit çözeltisi içine batırın. Gangliyonu salin perfüzyonlu elastomer kaplı yemeğe geri yerleştirin, böylece salin VSD boyamaya başlamadan önce glutaraldehiti yıkamasını sağlar.NOT: Bağ dokusunun ve iç kaslarının bu ışık düzeltmesi, görüntüleme sırasında hareketi önlemeye yardımcı olacaktır. Aplysia californica diseksiyonu Yaklaşık 40 g’lı bir hayvanı, 350 mM MgCl2’nin ~20 mL’lik kısmını ventral yüzeyden (ayak) vücuda enjekte ederek uyuşturun. Hayvan ventral tarafını balmumu kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirmek için pimleri kullanın. Diseksiyon makası kullanarak, ayağın en ön kısmı boyunca 2-3 cm orta çizgi kesiği yapın. CNS ve bukla kütlesinin bir kısmını ortaya çıkarmak için ayağın kapaklarını kesiğin her iki tarafına sabitle.NOT: CNS’nin kaynaşmış serebral gangliyon ve yakından uygulanmış, bilateral plevral ve pedal gangliyonundan oluşan ihtiyaç duyulan kısmı sarı-turuncudur ve çevre dokudan belirgindir; soğanlı kaslı bukuzal kütleye dorsal ve posterolateral oturur. Beyin gangliyonlarını ortaya çıkararak buktal kütleyi dikkatlice parçalamak için emiş ve diseksiyon makası kullanın. Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, sert ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS’yi genişletin, merkezi gangliyasyonu birbirine bağlayan tüm sinirleri sağlam tutun. Uzun bir pedal siniri 9 (PdN9) veya hangi sinir uyarılacaksa bırakın. CNS’yi tuzlu su dolu elastomer kaplı bir tabağa yerleştirmek için minutien pimleri kullanın. Yemeği bir Peltier soğutma cihazından geçen salinle perfüzyon yaparak hazırlık sıcaklığını 15-16 °C’de koruyun. Tokmaklar ve mikrodiseksiyon makası kullanarak, CNS’den aşırı bağ dokusunu çıkarın ve görüntülenecek ganglion veya gangliyon üzerindeki kılıfın yüzeysel bir kısmını parçalara çıkarın. Bu işlem sırasında kılı daralarda bir delik açmamaya dikkat edin, bu da nöronların içinden dökülmesine neden olur. Kısaca (~20 s) gangliyonu salin içinde% 0.5 glutaraldehit çözeltisi içine batırın. Gangliyonu salin perfüzyonlu elastomer kaplı yemeğe geri yerleştirin, böylece salin VSD boyamaya başlamadan önce glutaraldehiti yıkamasını sağlar. Berghia stephanieae’nin diseksiyonu Bir hayvanı uyuşturmak için buzdolabına yaklaşık 20 dakika yerleştirin. Oda sıcaklığında salinle dolu elastomer kaplı bir tabak kullanarak, minutien pimlerini hem kafaya hem de kuyruğa yerleştirin. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, CNS’ye yüzeysel olarak 5-7 mm sırt kesisi yapın.NOT: Gözler, CNS’nin yanında hayvanın içinde bulunan koyu lekeler, çift taraflı olarak kaynaşmış serebropleural ve pedal gangliyonlarından oluşan ve bukkal kütlenin üzerine oturan gerekli porsiyon CNS’nin konumunu uygun bir şekilde işaretler. Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, kümes hayvanları ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS’yi genişletin. Herhangi bir siniri bir emme elektrot için yeterince uzun süre uyarılmış bırakın. 4. Hazırlığı voltaja duyarlı bir boya ile lekelenin RH155 (NK3041 olarak da bilinir) veya RH482 (NK3630 veya JPW1132 olarak da bilinir) stok çözümleri hazırlayın. RH155: 5,4 mg katı boyayı 1 mL0 EtOH’da çözün, 34 mikrosantrifüj tüpünün her birine 29 μL pipetleme. Her tüpün içeriği havaya maruz kalarak, karanlıkta gece boyunca kurumasını bekleyin. Her biri 0,15 mg içeren RH155’in elde edilen katı aliquotlarını -20 °C dondurucuya kaplayın ve yerleştirin. RH482: 100 μL DMSO’da 2 mg katı boya çözün, çözeltiyi her biri 0,1 mg RH482 içeren 5 μL’lik 20 aliquot’a bölün ve -20 °C dondurucuda saklayın.NOT: Tritonia ve Aplysiaiçin, VSD RH155’i hazırlıktaki nöronların zarlarına yüklemek için banyo perfüzyonu veya basınç uygulaması kullanılabilir. Basınç uygulaması, sadece VSD’ye görüntülenmekte olan ganglionu açığa çıkarmak avantajına sahiptir. Banyo perfüzyonu için, yukarıdaki katı RH155 ve girdap aliquotlarının her ikisine 5 mL salin ekleyin ve 0.03 mg/ mL RH155 içeren 10 mL’lik birleşik bir çözelti üretin. Karanlıkta (fotobleaching önlemek için) Tritonia için 11 °C’de 1 ila 1,5 saat ve Aplysiaiçin 16 °C’de perfuse. Perfüzyon çözeltisini bir Peltier soğutma sisteminden geçirerek sıcaklığı koruyun. Basınç uygulaması için, RH155’in bir aliquotuna 500 μL salin ve 0,3 mg / mL boya konsantrasyonu üretmek için girdap ekleyin. Çözeltinin yaklaşık 200 μL’lik kısmını el tipi bir mikrodispenser kullanarak polietilen boruya çizin, bu da tüp çapı ile lekelenecek ganglionun çapı arasında iyi bir eşleşme olmasını sağlayın. Tüpün ucunun hedef ganglionun üzerine dikkatlice yerleştirilmesi için bir mikromanipülatör kullanın, ganglion üzerinde rahat bir mühür oluşturana kadar küçümseyin. Gangliyayı istenen sıcaklıkta tutmak için yukarıda açıklanan soğutma sistemi türünü kullanın. Fotobleaching önlemek için oda ışıklarını karartın ve ganglion üzerine daha fazla boya zorlamak için mikrodispenser aplikatör topuzunu her 5 dakikada bir çevirin. İyi bir leke oluştuğunu onaylamak için 30 dakikada kontrol edin ve ardından yaklaşık 1 saat boyunca toplam boyama süresine devam edin. Berghia’daboyama için, RH482’nin donmuş bir aliquot’una 1 mL salin ve çözünecek girdap ekleyin. Bu çözeltinin 200 μL’sini 800 μL salin ve girdap içeren bir mikrosantrifüj tüpüne çözeltiye aktarın ve % 0,1 DMSO ile salinde 0,02 mg/ml RH482’lik son bir boyama çözeltisi üretin. Tüm CNS’yi mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, fotobleachingi önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın ve yaklaşık 1 saat boyunca her 5-6 dakikada bir elle çalkalayın. İlk çözeltinin kalan 800 μL’lik kısmını buzdolabında saklayın ve sonraki preparatları lekelamak için 3 güne kadar kullanın. 5. Hazırlığı düzleştirin ve sinir stimülasyonu için ayarlayın NOT: Bu bölümdeki adımlar, fotobleachingi en aza indirmek için minimum aydınlatma altında veya yeşil ışıkla yapılmalıdır. Lekelemeden sonra, CNS’yi görüntüleme odasındaki saline batırın ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Görüntülenecek ganglion/ganglionun soluna ve sağuna silikon parçaları (Tritonya veya Aplysiaiçin) veya petrol jölesi damlalarını (Berghiaiçin) yerleştirin. Uygun büyüklükte bir cam parçasına veya plastik örtüye bastırın ve düzleştirin. Sıkıca bastırın, ancak nöronlara zarar vermek için çok sert değil.NOT: Preparatın dışbükey yüzeyinin bu şekilde düzleştirilmesi, daha fazla sayıda nöron parfokal yapacak, böylece kaydedilen nöron sayısını artıracak ve ayrıca görüntüleme sırasında preparatın hareketsiz hale getirilmesine yardımcı olacaktır. Fiktif bir motor programı ortaya çıkarmak için bir siniri uyarıyorsanız, ön ucu yaklaşık olarak sinir çapı kadar geniş olan bir emme elektrodu hazırlayın. Bunu, pe-100 polietilen borunun bir bölümünü bir alevin üzerinde dikkatlice eriterek ve boru segmentinin her iki ucunu hafifçe çekerek ve ardından elde edilen konik istediğiniz noktada keserek gerçekleştirin. Bir polietilen emiş elektrodunun konik ucundan küçük bir miktarda salin çekin, ardından uyarılacak sinirin ucunu, elektrodun arka ucuna kalın duvarlı, esnek polimer boru uzunluğu takarak ve negatif basınç uygulamak için ağız emme kullanarak. Elektrottaki salinin elektrik iletimini kesebilecek kabarcıklardan yoksun olduğunu doğrulayın. 6. Görüntüleme için hazırlık ve optimizasyon Odayı görüntüleme kulesine taşıyın. Salin perfüzyonunu kayıt odasından başlatın ve sıcaklık probunu preparatın yakınına yerleştirin. Görüntülenebilen türler için istenen sıcaklık için sıcaklık denetleyicisini ayarlayın (Tritonya, 11 °C, Aplysia, 15-16 °C veya Berghia, 26-27 °C için). Bir klorlu gümüş teli emme elektrodundan aşağı yerleştirin, elektrottaki salinle temas ettiğinden emin olun ve diğer Ag-AgCl telini (dönüş yolu) emme elektroduna yakın banyo salinine yerleştirin. Su daldırma lensini salin içine 2007’den fazla alçaltın. Taban diyaframını kapatın ve ardından substage kondenserini kaldırın veya kıtır kıtır ve diyaframın kenarları keskin netleme olana kadar odağı ayarlayın ve Köhler aydınlatması oluşturun. Görüntülenecek hazırlığın bölgesine odaklanın. Daha büyük nöronlardan kaynaklanan optik sinyaller, odak dışında olsalar bile daha küçük nöronlara göre kaydedilme olasılığı daha yüksek olduğundan, daha büyük nöronlar üzerinde daha küçük nöronlara odaklanan önyargı. Parfokal dijital kamera ile görüntülenecek ganglionun fotoğrafını çekin. Kontrol paneli kazanç anahtarı 1x olarak ayarlanmışken, “RLI” düğmesine tıklayarak ve diyotların ortalama RLI’sınıkontrol ederek görüntüleme yazılımındaki dinlenme ışığı yoğunluğunu (RLI) inceleyin. Bir uyarıcıdan LED lamba güç kaynağına gönderilen voltaj seviyesini ayarlayın ve ortalama RLI seviyesini istenen aralıkta (genellikle 3-4 V civarında) kontrol etmeye devam edin.NOT: PDA’da yaklaşık 3-4 V’ye karşılık gelen yüksek ILI’ler istenir. Işık ne kadar yüksek olursa, optik sinyallerin sinyal-gürültü oranı o kadar iyi olur, ancak bu, daha yüksek RLI’lerde daha hızlı bir fotobleaching oranına karşı dengelenmelidir. Yüksek NA objektif lensler kullanılarak bu risk en aza indirilür. Kullanılan suya daldırma objektif lensler 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA ve 40x/1.15 NA’dır. Kayıt için kontrol paneli kazanç anahtarını 100x olarak ayarlayın. Bir siniri uyarıyorsanız, istenen voltajı, frekansı ve süreyi ışık seviyesini ayarlamak için kullanılandan ayrı bir uyarıcıya ayarlayın. Kontrol paneli ve uyarıcı arasındaki TTL tetiklemesinin düzgün yapılandırıldığını onaylayın.NOT: Her türdeki örnek sinir uyaran parametreleri şunlardır: Tritonia PdN3, 2 s, 10 Hz nabız treni 5 ms, 10 V darbeler; Aplysia PdN9, 2.5 s, 5 ms 20 Hz darbeli tren, 8 V darbe; Bir Berghia pedal siniri, 2 s, 10 Hz nabız treni 5 ms, 5 V darbeler. Yay veya hava tablosunun yüzdüp yüzdüldüğünü iki kez kontrol edin. 7. Optik kayıt Tepegöz floresan aydınlatma da dahil olmak üzere oda ışıklarını kapatın veya karartın. İstediğiniz dosya süresini, yolu ve dosya adını ayarlayın ve ardından bilgisayarın kullanılabilir RAM kapasitesine kadar dosya almak için görüntüleme yazılımındaki “Veri Al” düğmesine tıklayın. Optik kayıt sırasında hareketsiz kalın, çünkü küçük titreşimler optik kayıt verilerine büyük eserler sokabilir.NOT: Bilgisayarın mevcut RAM’ini aşacak satın almalar için Georgetown Üniversitesi’nden Dr. Jian-young Wu aracılığıyla özel yapım bir C++ satın alma programı mevcuttur. Elde edildikten hemen sonra verileri görüntülemek için, görüntüleme yazılımındaki Superimpose işlevini kullanarak tüm 464 diyot tarafından toplanan verileri, hazırlık7’denönce çekilen ganglionun görüntüsü üzerine bindirmek için kullanın. Ayrı bir izleme ekranında kaydettiklerini genişletmek için yazılımda temsil edilen diyotlardan herhangi birine tıklayın. Daha önce iğne deliği testi tarafından belirlenen x, y ve büyütme faktörlerini girerek diyotların preparatla ilgili olarak tam hizalamasını elde edin. Eylem potansiyeli görünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak ve sonraki ani sıralama14için nöron verimini artırmak için, hem düşük hem de yüksek frekanslı gürültüyü gidermek için 5 Hz ve 100 Hz kesmelere sahip bir bandpass Butterworth filtresi uygulayın (görüntüleme yazılımında mevcuttur). Filtre uygulanmış optik verileri bilimsel bir bilgi işlem platformunda daha fazla analiz için metin dosyası olarak kaydetmek için, önce görüntüleme yazılımındaki “Sayfa” ekranının hemen altındaki “TP filtresi” kutusunu seçin. Ardından, “Çıktı” sekmesinden “Sayfayı ASCII Olarak Kaydet” i seçin ve görüntülenen iletişim kutusuna istediğiniz dosya adını girin.

Representative Results

TritoniaDenizyıldızı avcısı ile cilt teması, Tritonia diomedea’nın kaçış yüzmesini tetikler, onu güvenli bir yere iten ritmik bir dizi tüm vücut fleksiyondan oluşan (Şekil 3A). İzole beyin preparatlarında, sinir 3’ü (PdN3) pedallamak için kısa bir uyaran, pedal gangliyonundan optik kayıtlarda kolayca tanınabilen bu davranış için ritmik yüzme motor programını (SMP) ortaya çıkarır. Şekil 3B, PDA’nın konumlandırılmış olduğu sol Tritonia pedal ganglionunun dorsal yüzeyindeki nöronların ateşleme aktivitesini kaydetmek için tasarlanmış bir VSD görüntüleme deneyinin düzenini, SMP’yi ortaya çıkaran kontraseptif (sağda) PdN3’e bir uyarıcı olarak tasvir eder. PdN3’ün uyarılmasından önce, sırasında ve sonrasında 20 diyot kayıt aktivitesinden ham ve filtrelenmiş veriler (bandpass Butterworth filtresi, 5 ve 100 Hz kesmeler) sırasıyla Şekil 3C,D’de gösterilmiştir. Sinir uyaranı 2 dakika dosyasına 20 sn teslim edildi. Satın alındıktan hemen sonra, kayıt dizisinin tüm 464 diyotları tarafından ölçülen sinyaller, görüntüleme yazılımındaki preparatın bir görüntüsü üzerinde topoğrafik olarak görüntülenebilir (Şekil 3E). Bu noktada, birçok iz aynı nöronlardan gereksiz yere kaydedilen sivri uçları içerir ve bazı izler birden fazla nörondan sivri uçlar içerir. Filtrelenmiş diyot izlerini ICA ile basamak sıralayan 53 benzersiz nöronal iz elde edildi, bunların 30’u Şekil 3F’degösterilmiştir. Şekil 3G Şekil 3G’detek tek sivri uçların kinetiği takdir edilebilir Şekil 3F’den (kırmızı kutu) dört izden bir alıntıyı genişletir; ICA ani sıralama algoritmasının doğruluğu daha önce eşzamanlı keskin elektrot kayıtları kullanılarak doğrulanmıştır, bu da sıralanmış izlerdeki tüm ani artışların hücre içi olarak kaydedilen tek tek nöronlardan gelen ani artışlara karşılık geldiğinigöstermiştir 11,14. AplysiaAplysia californica’ya güçlü bir şekilde averik bir kuyruk uyaranı, kalıplaşmış iki parçalı ritmik bir kaçış tepkisi ortaya çıkarır15. Yanıtın ilk aşaması, hayvanı hızlı bir şekilde ileriye doğru hareket ettiren birkaç kafa akciğeri ve kuyruk çekme döngüsünden oluşan bir dörtnaladır. Bunu tipik olarak, hayvanı birkaç dakika daha yavaş bir hızda ileriye doğru yönlendiren tekrarlanan kafadan kuyruğa kas kasılma dalgalarını içeren bir emekleme dönemi izler (Şekil 4A). Optik kayıtlarda bu kaçış motoru programlarını yakalamak için, PDA izole bir beyin preparatında sağ pedal ganglionunun dorsal yüzeyine odaklandı ve kontralateral (sol) pedal siniri 9’a (PdN9; Şekil 4B). Sürekli 20 dakikalık optik kayıtta bir dakika (Şekil 4C), PdN9 dörtnala tarama motor programı dizisini ortaya çıkarmak için uyarıldı. Kaydedilen 81 nöronun tümünden gelen sinyallerin olasılıksal Gauss mekansal dağılımları ganglion üzerine eşlenmiştir (Şekil 4D). Tam kayda uygulanan boyutsallık azaltma, kaçış programının dörtnala (siyan) ve gezinme (koyu mavi) aşamalarının farklı alanları işgal ettiğini ve ana bileşen alanında sırasıyla spiral ve döngü benzeri farklı yörüngeler oluşturduğunu ortaya koydu (Şekil 4E). Şekil 4’te gösterilen Aplysia kaydına dayanan üç video, bu tür veri kümelerinde gerçekleştirilebilecek diğer analiz türlerini göstermektedir. Video 1, kaydedilen tüm nöronların kaydın tam süresi boyunca ateşlenmesine animasyonludur. Kaçış motor programının ilk uyarıcı sonrası dönemi, gangliondaki aktivitenin farklı fonksiyonel kümelerin alternatif patlamasıyla işaretlenen bir dörtnala ile karakterize edildi (Video 2). Dörtnala daha sonra, nöronal kümeler boyunca aktivitenin geniş ölçüde vurgulu kaldığı, ancak ganglion içinde saat yönünün tersine dönme yörüngesini üstlendiği bir taramaya geçiş yaptı (Video 3). İkinci iki video ayrıca, kaçış yanıtının dörtnala ve tarama aşamaları için farklı işlevsel toplulukların ateşlenmelerini ve konumlarını ayrı ayrı ortaya çıkaran konsensüs kümelemelerini içerir. Hem dörtnala hem de gezinme aşamalarında aynı kümeye atanan birçok nöronun, önceki bulgularla tutarlı olarak ganglion içinde birbirine fiziksel yakınlık sergilediğini unutmayın12. BerghiaAeolid nudibranch Berghia stephanieae (Şekil 5A) sinirbilim için yeni bir model sistemini temsil eder. Tipik bir Berghia deneyi için görüntüleme kurulumu Şekil 5B’de gösterilmiştir. Geniş ölçekli nöronal aktiviteyi ortaya çıkarmak için, en belirgin sol pedal sinirine bir emme elektrodu yerleştirildi ve bir sinir uyaranı 2 dakikalık bir kayda 30 sn iletildi. ICA tarafından işlenen izler 55 nöronda hem spontan hem de uyaran çağrışımlı aktiviteyi ortaya çıkardı (Şekil 5C). Konsensüs kümeleme yoluyla topluluk algılama, şekil 5D’de bir ağ grafiğinde ve Şekil 5E’de gösterilen ve kümeleme atamalarına göre Şekil 5C’de gösterilen izleri yeniden düzenleyen on farklı işlevsel topluluk tanımladı. Kaydedilen tüm nöronlardan gelen sinyallerin Gauss dağılımları, kaydedilen 55 nöronun tüm konumlarını belirtmek için Şekil 5F’deki preparatın bir görüntüsü üzerine bindirilir. Şekil 1: Optik görüntüleme teçhizatı ve fotodiyot dizisinin (PDA) görünümleri. (A) PDA, dijital kamera, mikroskop ve sahne içeren optik görüntüleme donanımı. (B) Fiber optiklerin görüntüleme diyaframını 464 fotodiyotlara bağladığı PDA’nın iç tasarımı. Fotodiyotların üzerinde bir sıra amplifikatör bulunur. (C) Görüntüleme diyaframının altıgen yüzü, görüntülenen alanın odaklandığı yerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Optik kayıtların eldeinde temel iş akışını gösteren bir akış çizelgesi. VSD görüntüleme protokolündeki, diseksiyon ve boyamadan görüntülemenin ayrıntılarına kadar temel adımlar bu akış çizelgesinde tasvir edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Tritonia diomedeasonuçları , ham, filtreed ve çivi sıralanmış verileri gösterir. (A) Yırtıcı deniz yıldızı Pycnopodia helianthoides’ten kaçan tritonia, vücudun alternatif dorsal ve ventral fleksiyonlarından oluşan yüzmesiyle. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce=serebropleural ganglionun serebral lobu; Pl = serebropleural ganglionun plevral lob; Pd = pedal ganglion. (C) 20 fotodiyottan elde edilen ham veriler, sol pedal ganglionunda kontraseteral PdN3’ün (okla gösterilen uyaran) uyarılmasına kadar aktivite gösterir. (D) C’dekiyle aynı diyotlardan süzilmiş veriler (5 ve 100 Hz bandpass Butterworth filtresi). (E) Tüm 464 diyot tarafından toplanan sıkıştırılmış izlerin preparatın bir görüntüsünün üzerine topografik olarak bindirildiği görüntüleme yazılımı çıktısı. İzleri C ve D olarak gösterilen 20 diyotun konumları kırmızı ile vurgulanır. (F) ICA ile başak tasnif yoluyla oluşturulan otuz seçilmiş tek nöron izi. (G) F’dekikırmızı kutuya karşılık gelen dört tek nöron izinin genişletilmiş görünümü, eylem potansiyellerini daha yüksek zamansal çözünürlükte görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Aplysia californicasonuçları , uzun süreli kayıt, sinyal haritalama ve boyutsallık azaltmayıgösterir. (A) Aplysia’nın sıralı kaçış motor programının iki aşaması, dörtnala ve emekleme. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce = beyin ganglionu; Pl = plevral ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) Sağ pedal ganglionunda 81 nöronun 20 dakikalık kaydı, kontralatör PdN9’a (okla gösterilir) bir uyarana yanıt verir. İzlerin altındaki yeşil, siyan ve koyu mavi çubuklar sırasıyla kaçış motor programının ön uyaran süresini, dörtnala ve tarama aşamalarını gösterir. (D) ICA tarafından tanımlanan 81 nöronal sinyal kaynağının tüm konumlarının haritalanmış olasılıksal Gauss dağılımları ile preparatın bir görüntüsü. Yeşil anahat, PDA’nın altıgen yüzünün ganglion ile ilgili konumunu temsil eder. Her Gaussian’daki sayılar C’dekieser sayılara karşılık gelir. (E) 20 dakikalık dosya boyunca ilk üç ana bileşeni birbirine karşı çizerek ana bileşen analizini kullanarak boyutsallık azaltma. Uyarıcı öncesi taban çizgisi, dörtnala ve gezinme dönemleri sırasıyla yeşil, siyan ve koyu mavi renkte gösterilir. Bu kayda karşılık gelen nöronal ateşleme animasyonları için Videolar 1-3’e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Berghia stephanieaesonuçları , sinirbilim için yeni bir tür, ağ grafiklerini, fonksiyonel kümelemeve ikili sinyal haritalamayıgöstermektedir. (A) Bir Berghia örneği. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce = serebropleural ganglionun serebral lobu; Pl = serebropleural ganglionun plevral lob; Pd = pedal ganglion; Rh = gergedan ganglionu. (C) Serebropleural gangliyondaki 55 bilateral nöronun spontan ve uyaranla uyarılmış aktivitesini gösteren izler (uyaranın teslimi okla gösterilir). (D) Konsensüs kümeleme yoluyla tanımlanan, her biri benzersiz bir renk atanmış on işlevsel topluluğu görüntüleyen bir ağ grafiği. Bu çizimdeki düğümler, ağ uzayındaki mesafenin topluluklar içinde ve arasında ateşleme korelasyon derecesini temsil ettiği nöronları temsil eder. (E) C’deki izler yeniden düzenlenir ve renk kodludur (D’ninrenk düzenini takip ederek) fonksiyonel topluluklar halinde. (F) Kaydedilen her nörondan gelen sinyallerin eşlenen konumlarını ve karşılık geldiği C ve E’deki eser numaraları gösteren preparatın görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Video 1: Tam animasyon, 20 dakikalık Aplysia kaçış lokomotor programı. Sağ pedal ganglionunda (sol panel) 81 ayrı nöronun üzerinde bulunan beyaz şekillerin opaklığı, karşılık gelen nöronal izler (sağ panel) tarafından yönlendirildi ve ortalama yükselme hızının bir işlevi olarak doğrusal olarak değişti (kayıtta her 0.61 sn’ye binned). Her nöron için, tam opaklık kayıt süresi boyunca maksimum atış hızına normalleştirildi. Videoda geçen sürenin bir saniyesi 12,2 sn gerçek zamanlıyı temsil eder. Ölçek çubuğu, sırasıyla kaçış lokomotor programının ön uyaran taban çizgisini, dörtnala ve gezinme aşamalarını gösteren izlerin altındaki yeşil, siyan ve koyu mavi çizgilerle gerçek zamanlıya karşılık gelir. Dörtnala aşamasının etrafındaki sarı kutular ve gezinme aşamasının bir kısmı, Videolar 2 ve 3’tekianimasyonları oluşturmak için kullanılan kayıt alıntılarını gösterir. Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.) Video 2: Aplysia kaçış lokomotor programının dörtnala aşamasının animasyonu. Konsensüs kümelenmesi, motor programının sadece dörtnala aşamasında kaydedilen 81 nöronun hepsinde fonksiyonel toplulukları türetmek için, açıklanan ve ref.12’deaçıklanan ve kullanıma sunulan yaklaşım ve yazılım kullanılarak gerçekleştirildi. Kaçış programının bu aşamasında büyük ölçüde tonik veya düzensiz ateşleme paternleri sergileyen nöronal topluluklar bu videodan çıkarıldı. Siyah ve zeytin yeşili topluluklara ait nöronların eylem potansiyelleri, videonun ses parçasında, ilgili nöronlar ve izler vurgulanarak duyulabilir. Ortalama ani artış oranları Video 1’de olduğu gibi ve eşdeğer zaman binning ile normalleştirildi; Videoda geçen 1 sn gerçek zamanlı 6.1 sn’ye karşılık gelir. Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.) Video 3: Aplysia kaçış lokomotor programının tarama aşamasının animasyonu. Fonksiyonel toplulukları türetmek için motor programının sadece emekleme aşamasında kaydedilen 81 nöronun hepsinde konsensüs kümelenmesi gerçekleştirildi. Motor programının bu aşamasında büyük ölçüde tonik veya düzensiz ateşleme desenleri sergileyen topluluklar bu videodan çıkarıldı. Ortalama artış oranları Video 1 ve 2’de olduğu gibi normalleştirildi ve eşdeğer zaman binning ile; Videoda geçen 1 sn gerçek zamanlı yaklaşık 12,2 sn’ye karşılık gelir. Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Discussion

Büyük ölçekli VSD görüntüleme yaklaşımımızı uygulamadaki en önemli ayrıntılardan biri, diyotlar boyunca kontrast kenarlarının hareketlerini üreten titreşimi en aza indirmek ve büyük yapısal sinyallerle sonuç vermektir. Absorbans VSD’leri eylem potansiyelleri ile ışık yoğunluğunda çok küçük yüzdeli değişiklikler ürettiğinden, titreşim eserleri, engellenmezse, ilginin nöronal sinyallerini gizleyebilir. Titreşim yapıtlarını en aza indirmek için çeşitli yöntemler kullanmaktadır. İlk olarak, görüntüleme odamız zemin katta yer almaktadır, bu da hazırlığı hava işleme ekipmanı ve diğer birçok kaynakla ilgili titreşimlerden izole eder. İkincisi, diğer PDA kullanıcılarının daha yaygın hava tablosu16’dandaha iyi titreşim sönümleme sağladığını onayladığı yay tabanlı bir izolasyon tablosu kullanıldı. Üçüncü olarak, yüzey dalgalanmalarından kaynaklanan görüntü dalgalanmalarını ortadan kaldıracak su daldırma hedefleri kullanılmıştır. Dördüncüsü, görüntülenen preparat, oda kapak alt kısmı ile silikon fişler veya petrol jölesi tarafından yerinde tutulan yukarıdan bastırılmış bir kapak parçası arasında hafifçe bastırılarak preparat daha da stabilize edildi. Bu aynı zamanda ganglion veya gangliyonun dışbükey yüzeyinin görüntülendiğini düzleştirerek, hedefin odak düzleminde daha fazla nöronla sonuçlanır ve bu da kaydedilen nöron sayısını arttırır.

Bir eylem potansiyelinden kaynaklanan VSD ışık emicilik derecesindeki çok küçük değişiklikler için sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için, PDA’ya hazırlık yoluyla neredeyse doygun ışığı elde etmek ve aynı zamanda boyanın fotobleachingini en aza indirmek önemlidir. Bu amaçla, genellikle 1x konumda PDA kontrol paneli kazanç anahtarı ile ölçüldüğü gibi 3-4 V dinlenme ışığı yoğunluğunda çalışırız (PDA’nın 464 amplifikatörü 10 V ışıkta doygunluğa sahiptir). Veri toplama sırasında bu kazanç faktörü 100x olarak değiştirilir. PDA tarafından ölçülen 3-4 V’ye ulaşmak için yeterli ışık almak çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kullanılan emicilik boyasının emilim özelliklerine uygun bir dalga boyu sağlayan ultra uçucu bir LED ışık kaynağı kullanın. Buna göre, RH155 ve RH482’nin optimum emilim dalga boylarıyla örtüşen 735 nm LED kolimli lamba kullanıldı. İkincisi, gerekirse, LED ışık kaynağından daha küçük bir alana ışığı yoğunlaştırıcı bir flip-top substage kondenser kullanın. Üçüncü olarak, yüksek, hatta parlaklık ve maksimum görüntü kalitesi sağlayan Köhler aydınlatmasını elde etmek için kondenser yüksekliğini ayarlayın. Dördüncüsü, optik yolda LED lambanın 735-nm dalga boylarını hafifletebilecek ısı filtreleri olmadığından emin olun. Beşinci olarak, daha fazla ışık gerekiyorsa difüzörleri optik yoldan çıkarın. Altıncı olarak, yüksek uzamsal çözünürlük sağlayan ve daha düşük lamba yoğunluklarında PDA’ya yeterli ışık seviyelerinin ulaşmasını sağlayan yüksek NA hedeflerini kullanın. Bu, tüm dosyalarda aynı ışık yoğunluğunu kullanarak ve önemli bir sinyal genliği kaybı veya yeniden boyama ihtiyacı olmadan hazırlık başına 10-20 dakikalık birkaç alım dosyası elde edebileceğimiz ölçüde fotobleachingi en aza indirmemize izin verdi. En önemlisi, deneyci nöronları bu uzun dosyalar arasında izlemek istiyorsa, odak düzleminin değişmemesini ve hazırlığın hareket etmediğinden emin olun. Son olarak, PDA’ya yeterli ışığı yönlendirmenin ek bir yolu, daha ince ve dolayısıyla daha az opak gangliyona sahip daha genç hayvanları kullanmaktır.

Zaman zaman optik sinyallerin sinyal-gürültü oranının bozulduğunu ve/veya motor programı ritimlerinin yetersiz (örneğin, yavaş veya anormal) olduğunu görüyoruz. Bu tutarlı bir şekilde gerçekleşmeye başladığında, VSD’nin yeni çözümlerini karıştırıyoruz. VSD aliquots genellikle -20 °C dondurucuda yaklaşık 6 ay boyunca canlı kalır. İlgili olarak, Berghiaiçin şimdiye kadar emici VSD RH482 ile en iyi sonuçların elde edildiğini belirtmek gerekir. RH482, RH155’ten daha fazla lipofilik olduğundan, Berghia’nınnispeten daha küçük nöronlarını daha iyi lekeleyebilir veya bu tropikal türler için kullanılan daha yüksek kayıt salin sıcaklığında nöronal zarlarda daha etkili bir şekilde kalabilir.

Nöral aktivitenin PDA tabanlı görüntülenmesinin bir sınırlaması, 100x önamplifikasyon adımından önce donanımdaki voltaj sinyallerinin AC bağlantısı ile ilgilidir: bu, bu tekniğin gerektirdiği yüksek dinlenme ışığı seviyesinin ürettiği büyük DC ofsetini çıkarmak için gerekli bir özelliği temsil etse de, PDA’ya içsel olarak ac bağlantısı, membran potansiyelinde yavaş değişikliklerin ölçülmesine engeldir, sinaptik girişlerle ilişkili olanlar gibi. Yavaş veya sabit durumda potansiyel değişiklikler kaydetmek isteniyorsa, alt koruma etkinliğini yakalamak için DC bağlantılı bir CMOS kamera görüntüleme sistemi kullanılabilir. Byrne ve meslektaşları son zamanlarda Aplysia17,18buccal ganglion nöronların aktivitesini görüntüleyemek için RH155 ile böyle bir kurulum kullandılar. Her iki sistemi de kullandık ve CMOS kameranın, çok daha yüksek dedektör yoğunluğu (128 x 128) nedeniyle, aynı görüntüleme süresi için 50 kat daha büyük veri dosyaları ürettiğini gördük7. PDA’nın daha küçük dosyaları daha hızlı işleme ve analiz sağlar. Bu aynı zamanda genişletilmiş tek deneme kayıtlarına (Şekil 4) ve birden fazla denemeden elde edilen verilerin başak sıralamadan önce tek bir büyük dosyada birleştirilmesine izin veren öğrenme çalışmalarına olanak tanır ve öğrenme geliştikçe ağ organizasyonunun izlenmesini sağlar19.

Diğer kamera tabanlı araştırmalarda, floresan VSD’ler Kristan ve meslektaşları tarafından sülük segmental gangliyonunda ağ işlevini incelemek için kullanılmıştır. Etkili bir çalışmada bu, hayvanın yüzme veya emekleme kararında yer alan bir nöronun tanımlanmasına yol açtı20. Başka bir çalışmada, Kristan ve arkadaşları sülüklerin yüzme ve emekleme davranışlarının çok işlevli ve özel devreler tarafından ne ölçüde yönlendirilmelerini inceledi21. Daha yakın zamanda, Wagenaar ve meslektaşları, bir sülük segmental ganglion22’dekihemen hemen tüm nöronlardan kayıt yapmalarını sağlayan voltaj görüntüleme için iki taraflı bir mikroskop kullandılar. Birçok kamera tabanlı görüntüleme yönteminin aksine, PDA tabanlı görüntüleme yöntemimizin bir avantajı, sonuçların işlenmesi için nöronal sınırlar hakkında hiçbir karar içermeyen bir kör kaynak ayırma şekli olan ICA tarafından hızlı ve tarafsız ani sıralamadır.

VSD’lerin seçimi ile ilgili olarak, emici boyaların RH155 ve RH482’nin biravantajı,floresan VSD’ler için tipik olandan daha uzun kayıt süreleri sağlayan23,24ile ilişkili az veya hiç fototoksikliktir. Ayrıca, kullandığımız hızlı emici VSD’ler, gastropod preparatlarında genellikle genlikte 80 mV olan aşırı somatik eylem potansiyellerini kaydetmek için çok uygundur. Şekil 3G’degösterildiği gibi, optik yöntemimiz eylem potansiyeli az çekimlerini kaydedebilir (kayıtlarımızın hiçbiri izleme ortalamasına sahip değildir): bu, kullandığımız VSD’lerin bir dereceye kadar zayıflayan ve bu nedenle somaya ulaştıklarında aşırı çekim yapmayan diğer model sistemlerindeki eylem potansiyellerini ayırt edebilmesi gerektiğini göstermektedir. Bununla birlikte, optik yaklaşımımız soma’da kaydedildiğinde oldukça zayıflatılmış eylem potansiyelleri sergilediği bilinen türler için ideal olmayabilir.

Sinir ağları üzerine yapılan çok güncel araştırmalar az sayıda tasarımcı transgenik türe odaklanmıştır. Bununla birlikte, nörobilim filogenetik olarak farklı çok çeşitli türlerin çalışmasından yararlanır. Birçok farklı türü incelemek, devrelerin 25,26‘yı nasıl evrimleştiğine dair içgörüler sağlar ve phyla1 ,2,3,4,27’deyaygın olabilecek ağ işlevi ilkelerini aydınlatır. Şimdiye kadar görüntüleme yöntemimizi Aplysia californica8 , 11 , 12,13,14,28, Tritonya diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, dahil olmak üzere bir dizi gastropod türüne uyguladık. Pleurobranchaea californica (yayınlanmamış veriler) ve en son Berghia stephanieae (Şekil 5). Bu yaklaşımın bir çekiciliği, transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan birçok türe kolayca uygulanabilmesidir. Hızlı emici boyalar ve bir PDA ile VSD görüntüleme kullanımımızın, Navanax29 ve Aplysia30 hazırlıklarında yarı bozulmadan bunu başaran öncü çalışmaların izinden gittiğini kabul etmek istiyoruz. Yaklaşımımızın hızlılığına vurgumuz kısmen, birçok araştırmacının nörobilime geniş ilgi gösteren bilimsel soruları araştıramadan önce temel ağ organizasyonununu karakterize etmek için yıllarca çalışmanın gerekli olacağı korkusu nedeniyle yeni türlerde ağ çalışmaları başlatmakta giderek daha isteksiz olabileceği endişelerine bir cevaptır31. Bu nedenle, buradaki amacımız süreci büyük ölçüde hızlandıran bir teknik göstermektir – ağ organizasyonu hakkında tek bir hazırlıktan önemli aynı gün içgörüleri elde edilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NSF 1257923 ve NIH 1U01NS10837 tarafından desteklendi. Yazarlar Jean Wang’ın laboratuvardaki yardımını kabul etmek istiyor.

Materials

Achromat 0.9 NA swing condenser Nikon N/A
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 with SC-20 Controls perfusion saline temperature
Chamber thermometer Physitemp BAT-12 with IT-18 microprobe
Digital camera Optronics S97808
Dissecting forceps Dumont #5
Dissecting scissors American Diagnostic Corp. ADC-3410Q
Imaging microscope Olympus BX51WIF
Imaging perfusion chamber Siskiyou PC-H
Instant Ocean Instant Ocean SS6-25 Makes 25 gallons at a time
Master-8 pulse stimulator A.M.P.I. Master-8
Microdispenser Drummond Scientific 3-000-752 Dye applicator for pressure staining
Microdissection scissors Moria 15371-92
Minutien pins (0.1 mm) Fine Science Tools NC9677548 For positioning and stabilizing CNS
Motorized microscope platform Thorlabs GHB-BX Gibraltar platform
NeuroPlex imaging software RedShirtImaging NeuroPlex Compatible with the WuTech photodiode array
Objective lenses Olympus XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340
PE-100 polyethylene tubing VWR 63018-726 Tubing to make suction electrodes
Perfusion pump Instech P720 with DBS062SDBSU tube set
Petroleum jelly Equate NDC 49035-038-54
Photodiode array with control panel WuTech Instruments 469-IV photodiode array Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information
RH155 Santa Cruz Biotechnology sc-499432 Voltage-sensitive dye
RH482 Univ of Conn. Health Center JPW-1132 Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow
Silicone earplugs Mack's Model 7 To be use for preparation compression
Staining PE tubing VWR 63018-xxx Different sizes depending on fit
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Thorlabs LED and driver Thorlabs M735L2-C1, DC2100 LED lamp and driver
Tygon tubing Fisher Scientific 14-171-xxx
Vibration isolation table Kinetic Systems MK26 Spring-based
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
  2. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
  3. Bolker, J. Model organisms: There’s more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
  4. Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
  5. Chase, R. . Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , (2002).
  6. Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
  7. Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
  8. Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
  9. Frost, W. N., Wu, J. -. Y., Covey, E., Carter, M. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. , 169-195 (2015).
  10. Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
  11. Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
  12. Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
  13. Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
  14. Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N., Naik, G. R. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. , 235-246 (2012).
  15. Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
  16. Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
  17. Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
  18. Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
  19. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
  20. Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
  21. Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
  22. Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
  23. Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
  24. Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
  25. Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
  26. Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic’s Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
  27. Frost, W. N., Tian, L. -. M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
  28. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
  29. London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
  30. Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
  31. Marder, E., North, G., Greenspan, R. J. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. , 1-18 (2007).

Tags

Photodiode ArrayVoltage-sensitive DyesAction PotentialsNeural ActivityOptical ImagingNon-transgenic InvertebratesAplysia CalifornicaCentral Nervous SystemGlutaraldehydeRH 155 DyeMicrodispenserPolyethylene TubingSingle-neuron ResolutionNetwork Dynamics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hill, E. S., Brown, J. W., Frost, W. N. Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates. J. Vis. Exp. (161), e61623, doi:10.3791/61623 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image