非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

注 : 以下のワークフローの概要を 図 2に示します。 1. 振動を最小限に抑える 可能であれば、リグが1階にあることを確認し、エアテーブルよりも広い範囲の振動周波数を減衰させるスプリングベースの分離テーブルを使用します。 ばねベースのテーブルを使用する場合は、それがフローティングであることを確認します(テーブルに何かを追加したり取り外すたびに調整する必要があります)。 必要に応じて、撮像中の気流を遮断する程度であっても、撮像室の振動ベースの騒音を可能な限り低減します。灌流システムにおける流体乱流に起因する振動を最小限に抑えます。注: 取得中に神経の準備を動かしてはいけません。あらゆる種類の動きは、ダイオードを横切るコントラストエッジのシフトを生じ、実際の信号を作り出します。この手順が取得時に刺激を伴う場合、準備の動きを誘発してはならない。 2. ピンホールテストを実行して、ガングリオン写真とPDAデータの適切な位置合わせを可能にする 小さな穴が3つ入ったアルミホイルを顕微鏡のスライドに置きます。そのパーフォーカルフォトポートに取り付けられたデジタルカメラで3つの穴の画像を撮ります。 PDAに付属のイメージングソフトウェアを使用して、短いファイル(例えば、5 s)を取得します。取得の途中で、テーブルをタップしてピンホールの縁の周りに非常に目に見える振動アーティファクトを誘導し、ピンホールの画像を光学データと正確に整列させます。 メニュー項目「表示」にあるイメージングソフトウェアで スーパーインポーズ 機能を使用|ページのスーパーインポーズ |外部イメージ|を使用してトレースを重ね合わせる「画像を重ね合わせる」は、ダイオードデータをピンホールの写真にオーバーレイし、ピンホールがダイオードデータのピンホールアーチファクトのすぐ上に置かれるまで、写真のx、y、倍率の設定を繰り返し調整します。 これらの数字を保存して、カメラで撮影した準備画像を、今後の実験でダイオードデータと一致させます。注: PDA のピンホールアライメントは、PDA を顕微鏡に取り付けた後、回転または取り外しが完了するまで 1 回だけ実行する必要があります。 3. 3種の海洋ガストロポッド種の切片 トリトニアやアプリシアのような大きなサイズに成長する種の場合、より薄く、不透明でない神経節を持つ小さな個体から始まり、最適な信号対雑音に十分な光を得ることを緩和する。 分節および画像実験のための生理的な物として使用される準備ができる人工海水を持っている。注: プロトコルの以降のすべてのステップでは、「生理」は人工海水を意味します。 トリトニア・ディオメデアの解剖 動物を冷蔵庫に20分ほど置き、麻酔をします。 大きな動物の場合は、動物を片手に持って脳を露出させ、頭の端を人差し指の上にドレープして「首」を露出させます。小さな動物の場合は、脳を露出する前に、ワックスが並んだ解剖皿に後側をピン留めします。 解剖はさみを使用して、動物の側側、頬の塊(体壁を通して感じることができる)の上に3〜4センチメートルの正中線切開を行います。注:CNSの必要な部分は、融合された両側性脳胸骨とペダル神経節からなり、オレンジ色で周囲の組織とは異なる外観です。それはサイの後部と頬の塊の上にあります。 鉗子とマイクロディセクチャを使用して動物の体を内面化する神経を切断し、中央神経節をつなぐすべての神経をそのまま維持することによってCNSを切除する。ペダル神経3(PdN3)の長い長さを残すか、または神経が刺激されるいずれかの。 minutienピンを使用して、生理食糸で満たされたエラストマー裏地の皿の底にCNSを貼り付け、さらなる解剖を行います。蠕動ポンプを使用してフィードバック制御、インラインペルティエ冷却システムと配信された生理食物と料理を浸透させることによって、11 °Cで準備温度を維持します。 鉗子とマイクロディスセクションはさみを使用して、CNSの周囲から結合組織の緩やかに付着した層を慎重に取り除きます。細かい鞘をガングリアに密接に付着したままにしておきます。 簡単に (10 s) 生理食道中の 0.5% グルタルアルデヒドの溶液に神経節を浸します。食後に戻って神経節を食べ物を入れ、生理食類を使ってVSD染色を開始する前にグルタルアルデヒドを洗い流します。注:結合組織とその固有の筋肉のこの光の修正は、イメージング中の動きを防ぐのに役立ちます。 時立性カリフォルニカの解剖 約40gの動物を、腹側表面(足)を通して約20mLの350mMMgCl2 を体内に注入して麻酔をします。 ピンを使用して、動物の腹側をワックスで並べた解剖皿に並べます。 解剖はさみを使用して、足の最も前部の範囲に沿って2〜3センチメートルの正中線切開を行います。切開の両側の足のフラップをピン留めして、CNSと頬の質量の一部を明らかにします。注:CNSの必要な部分は、融合した脳神経節からなり、密接にアパポーズされた両側胸膜とペダル神経節は黄色オレンジ色で、周囲の組織とは外観が異なります。それは球根性筋頬の塊に後部および後部に座る。 鉗子と解剖はさみを使用して、頬の塊を慎重に解剖し、脳神経節を明らかにする。 鉗子とマイクロディセクチャを使用して動物の体を内面化する神経を切断し、中央神経節をつなぐすべての神経をそのまま維持することによってCNSを切除する。ペダル神経9(PdN9)の長い長さを残すか、または神経が刺激されるいずれかの。 minutienピンを使用して、生理食糸で満たされたエラストマー裏地の皿にCNSを配置します。ペルチェ冷却装置を通して生理食い物を皿に浸透させることによって15-16 °Cで準備温度を維持する。 鉗子とマイクロディセクチャを使用して、CNSから過剰な結合組織を取り除き、画像化されるガングリオンまたは神経節の鞘の表面的な部分を解剖する。このプロセス中に、鞘に穴が開かないように注意してください。 簡単に (20 s) 生理食道中の 0.5% グルタルアルデヒドの溶液に神経節を浸します。食後に戻って神経節を食べ物を入れ、生理食類を使ってVSD染色を開始する前にグルタルアルデヒドを洗い流します。 ベルガ・ステファニーの解剖 動物を冷蔵庫に20分ほど置き、麻酔をします。 室温の生理食物で満たされたエラストマー裏地の皿を使用して、頭と尾の両方にminutienピンを置きます。 マイクロディションハサミを使用して、5〜7mmの後部切開をCNS表面にします。注:目は、CNSの横の動物の中に存在する暗い斑点は、二国間で融合した脳胸骨とペダル神経節から成り、頬の塊の上に座っている必要な部分CNSの位置を便利にマークします。 鉗子とマイクロディセクチャを使用して動物の体を内面化する神経を切断することによってCNSを切除する。吸引電極のために十分に長く刺激されている任意の神経を残します。 4. 分圧性染料で調製を汚す RH155(NK3041とも呼ばれる)またはRH482(NK3630またはJPW1132としても知られている)のいずれかのストック溶液を準備します。 RH155: 5.4 mgの固形色素を1mLの100%EtOHに溶解し、29 μLを34マイクロ遠心チューブのそれぞれにピペット化します。各チューブの内容物を空気にさらして、暗闇の中で一晩乾燥させます。得られた固形アリコートを、それぞれ0.15mgを含むRH155の固形アリコートを、-20°Cの冷凍庫に入れる。 RH482: 2 mg の固形色素を DMSO の 100 μL に溶解し、溶液を 20 個のアリコート 5 μL に分割し、それぞれ 0.1 mg の RH482 を含み、-20 °C 冷凍庫に保存します。注意: トリトニア および 無呼吸の場合、浴灌流または圧力適用は、調製中のニューロンの膜にVSD RH155をロードするために使用することができる。圧力アプリケーションには、VSDに画像化されているガンギだけを公開するという利点があります。 浴灌流の場合、固体RH155と渦の2つのアリコートのそれぞれに生理食塩水を5 mL加えて溶液に入れ、0.03 mg/mL RH155を含む10 mLの結合溶液を製造する。 暗闇の中で(光の漂白を避けるために)トリトニアの場合は11°C、Aplysiaの場合は16°Cで1〜1.5時間のパーフューズ。 ペルチェ冷却システムを介して灌流液を通過させることにより、温度を維持します。 圧力適用のために、RH155の1つのアリコートに500 μLの生理食塩水を加え、渦を加え、0.3 mg/mLの染料濃度を作り出す。 ハンドヘルドマイクロディスペンサーを使用して溶液の約200 μLをポリエチレンチューブに引き込み、チューブ径とガングリオンの直径との間に良好な一致が見られるようにします。 マイクロマニピュレーターを使用して、チューブの端をターゲットの神経節の上に慎重に配置し、ガングリオンにぴったりしたシールを形成するまで下げます。上記の冷却システムの種類を使用して、江疽神経系を所望の温度に保ちます。 部屋のライトを暗くして光の漂白を避け、5分ごとにマイクロディスペンサーアプリケーターノブを回して、より多くの染料をガングリオンに押し付けます。 30分で良好な染色が行われていることを確認し、約1時間の完全染色時間を継続します。 ベルヒアで染色する場合は、RH482の凍結アリコートに1mLの生理食塩水を加え、渦を溶かします。 この溶液の200 μLを、800 μLの生理食糸と渦を含むマイクロ遠心分離チューブに溶液に移し、0.1%DMSOの生理食糸で0.02 mg/ml RH482の最終染色液を生成します。 CNS全体をマイクロ遠心チューブに入れ、チューブをアルミニウム箔で包み、光の漂白を避け、5~6分ごとに手で1時間ほど振ります。最初の溶液の残りの800 μLを冷蔵庫に保管し、その後の調製物を染色するために最大3日間使用します。 5. 準備を平らにして神経刺激を設定する 注: このセクションの手順は、光の点滅を最小限に抑えるために、最小限の照明または緑色のライトで実行する必要があります。 染色後、CNSを撮像チャンバー内の生理食い物に浸し、解剖顕微鏡の下に置きます。 シリコーン片( トリトニア または Aplysia用)または石油ゼリーの塊( ベルジア用)を、ガングリオン/神経節の左右に配置して画像化します。 適切なサイズのガラスまたはプラスチック製のカバースリップを準備に押し下げて平らにします。しっかりと押すが、ニューロンを損傷するほど難しくない。注:この方法で準備の凸面を平らにすると、より多くのニューロンが共焦点を引き起こし、それによって記録されるニューロンの数が増え、さらにイメージング中に準備を固定するのに役立ちます。 神経を刺激して架空の運動プログラムを引き出す場合は、前先端が神経径とほぼ同じ幅の吸引電極を用意します。これを実現するには、PE-100ポリエチレンチューブのセグメントを炎の上で慎重に溶融させ、チューブセグメントの両端をそっと引っ張り、目的のポイントでテーパーを切断します。 ポリエチレン吸引電極の先細り端部を通して少量の生理焼言を引き、続いて刺激される神経の端部を、電極の後端に厚い、柔軟なポリマーチューブの長さを取り付け、口の吸引を使用して負圧を加える。 電極の生理的な部分に、電気伝導を中断する気泡が欠けていることを確認します。 6. イメージングの準備と最適化 チャンバーをイメージングリグに移動します。記録チャンバーを通して生理食糸灌流を開始し、準備の近くに温度プローブを置きます。画像化される種に必要な温度コントローラを設定します(トリトニア、11°C、Aplysia、15-16 °C、またはベルジア、26〜27°C)。 1本の塩化銀線を吸引電極の下に置き、電極内の生理食塩水に接触することを確認し、もう一方のAg-AgClワイヤー(リターンパス)を吸引電極の近くの浴塩水に入れます。 水浸漬レンズを生理食糸に下げます。ベースダイヤフラムを閉じてから、サブステージコンデンサを上げたり下げたりして、ダイアフラムのエッジが鋭い焦点になるまで焦点を調整し、ケーラーのイルミネーションを作成します。 画像化する準備の領域に焦点を当てます。大きなニューロンに由来する光学信号は、少し焦点が合っていない場合でも登録される可能性が高いため、より大きなニューロンよりも小さなニューロンに焦点を当てたバイアスが登録される可能性が高くなります。 パーフォーカルデジタルカメラで撮影するガングリオンの写真を撮ります。 コントロールパネルのゲインスイッチを1xに設定し、「RLI」ボタンをクリックし、ダイオードの平均RLIを確認して、イメージングソフトウェアの安静光強度 (RLI)を検査します。刺激装置からLEDランプ電源に送られる電圧レベルを調整し、希望の範囲(通常は3-4 V前後)になるまで平均RLIレベルのチェックを続けます。注: PDA の約 3 ~ 4 V に対応する高い Rli が望ましいです。光が高いほど光信号の信号対雑音比が良くなりますが、これは高いRlIでの光漂白速度とバランスを取る必要があります。このリスクは、高NA対物レンズを使用することで最小化されます。使用される水浸し対物レンズは、10x/0.6 NA、20x/0.95 NA、40x/0.8 NA、および40x/1.15 NAです。 記録用にコントロールパネルのゲインスイッチを100倍に設定します。 神経を刺激する場合は、光レベルを設定するために使用される刺激装置とは別の刺激装置に、希望する電圧、周波数、および持続時間を設定します。コントロールパネルと刺激装置の間でTTLトリガが正しく設定されていることを確認します。注:各種のサンプル神経刺激パラメータは次のとおりです: トリトニア PdN3、2 s、10 Hzパルス列5 ms、10 Vパルス; 時立 PdN9、2.5 s、20 Hzパルス列5 ms、8 Vパルス; ベルガの ペダル神経、2 s、5 ms、5 Vパルスの10 Hzパルス列。 ばねまたは空気テーブルが浮いているか再確認してください。 7. 光記録 室内の照明をオフにするか、または暗くします(オーバーヘッド蛍光灯を含む)。 目的のファイルの継続時間、パス、およびファイル名を設定し、イメージング ソフトウェアの [データの取得] ボタンをクリックして、コンピュータの使用可能な RAM 容量までファイルを取得します。小さな振動が光記録データに大きなアーチファクトを導入する可能性がありますので、光記録中はそのまま残ります。注: コンピュータの利用可能な RAM を超える取得については、ジョージタウン大学の Jian-young Wu 博士を通じて、カスタムメイドの C++ 取得プログラムを利用できます。 取得直後にデータを表示するには、撮像ソフトウェアで スーパーインポーズ 機能を使用して、464ダイオード全てによって収集されたデータを、前の準備7で撮影したガングリオンの画像に重ね合わせる。ソフトウェアに示されているダイオードのいずれかをクリックすると、別のトレース画面に記録された内容が展開されます。 ピンホール試験であらかじめ決められたx、y、倍率を入力して、準備に対してダイオードの正確な位置合わせを実現します。 アクションポテンシャルの可視性を最大化し、その後のスパイクソート14のニューロン収量を改善するために、5 Hzと100 Hzのカットオフ(イメージングソフトウェアで利用可能)を備えたバンドパスバターワースフィルタを適用して、低周波ノイズと高周波ノイズの両方を除去します。 科学コンピューティング プラットフォームで、さらに分析するためにフィルタ処理された光学データをテキスト ファイルとして保存するには、まずイメージング ソフトウェアの [ページ] 画面の下にある[TP フィルタ] ボックスを選択します。次に、[出力] タブの[ページを ASCII 形式で保存] を選択し、表示されるダイアログ ボックスに目的のファイル名を入力します。