Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa
Summary
A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.
Abstract
Os recém-nascidos têm um risco aumentado de sepse bacteriana devido ao perfil imunológico único que apresentam nos primeiros meses de vida. Estabelecemos um protocolo para estudar a patogênese de E. coli O1:K1:H7, um sorotipo responsável pelas altas taxas de mortalidade em recém-nascidos. Nosso método utiliza imagens intravitais de filhotes neonatais em diferentes momentos durante a progressão da infecção. Essa imagem, paralelamente pela medição de bactérias no sangue, perfil inflamatório e histopatologia tecidual, significa uma abordagem rigorosa para entender a dinâmica da infecção durante a sepse. No relatório atual, modelamos dois inóculos infecciosos para comparação de cargas bacterianas e gravidade da doença. Descobrimos que a infecção subescapular leva à infecção disseminada por 10h após a infecção. Às 24 horas, a infecção da E. coli luminescente era abundante no sangue, pulmões e outros tecidos periféricos. A expressão de citocinas inflamatórias nos pulmões é significativa às 24h, sendo seguida por infiltração celular e evidência de danos teciduais que aumentam com a dose infecciosa. A imagem intravital tem algumas limitações. Isso inclui um limiar de sinal luminescente e algumas complicações que podem surgir com recém-nascidos durante a anestesia. Apesar de algumas limitações, descobrimos que nosso modelo de infecção oferece uma visão para entender a dinâmica da infecção longitudinal durante a sepse murina neonatal, que não foi completamente examinada até o momento. Esperamos que este modelo também possa ser adaptado para estudar outras infecções bacterianas críticas durante o início da vida.
Introduction
A sepse bacteriana é uma preocupação significativa para os recém-nascidos que exibem um perfil imunológico único nos primeiros dias de vida que não fornece proteção adequada contra infecção1. A sepse neonatal continua a ser um problema significativo de saúde nos EUA, representando mais de 75.000 casos anualmente apenas nos EUA2. Para estudar essas infecções em profundidade, novos modelos animais que recapitulam aspectos da doença humana são necessários. Estabelecemos um modelo de infecção por camundongos neonatais usando Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli é a segunda principal causa de sepse neonatal nos EUA, mas responsável pela maioria da mortalidade associada à sepse4,5. No entanto, é a principal causa quando os bebês pré-termo e muito baixo peso ao nascer (VLBW) são considerados independentemente5. O sorotipo K1 é mais frequentemente associado com infecções invasivas da corrente sanguínea e meningite em recém-nascidos6,7. Atualmente, não há outras opções de tratamento além de antibióticos e cuidados de apoio. Enquanto isso, as taxas de resistência a antibióticos continuam a aumentar para muitas bactérias patogênicas, com algumas cepas de E. coli resistentes a uma infinidade de antibióticos comumente usados no tratamento8. Assim, é imprescindível que continuemos a gerar métodos para estudar os mecanismos da sepse e a resposta do hospedeiro em recém-nascidos. Esses resultados podem ajudar a melhorar os tratamentos atuais e os desfechos de infecção.
O estado imunológico dos recém-nascidos é caracterizado por diferenças fenotípicas e funcionais em comparação com os adultos. Por exemplo, níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e regulatórias, como a interleucina (IL)-10 e IL-27, mostraram-se produzidas por macrófagos derivados do sangue do cordão umbilical e estão presentes em níveis maiores no soro dos recém-nascidos murinos9,10,11. Isso é consistente com níveis mais baixos de IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 e TNF-α que são frequentemente relatados a partir de células neonatais em comparação com as contrapartes adultas10. Além disso, o sistema imunológico neonatal é inclinado para uma resposta celular T Th2 e regulamentar em comparação com adultos12. Números elevados de neutrófilos, células T, células B, células NK e monócitos também estão presentes em recém-nascidos, mas com prejuízos funcionais significativos. Isso inclui defeitos na expressão de marcadores de superfície celular e apresentação de antígeno que sugerem imaturidade13,14,15. Além disso, os neutrófilos neonatais são significativamente deficientes em sua capacidade de migrar para fatores quimotacticos16. As células supressoras derivadas de meloides (MDSCs) também são encontradas em níveis elevados em recém-nascidos e recentemente mostradas como fonte de IL-2711. Os MDSCs são altamente supressivos em relação às célulasT 17. Coletivamente, esses dados demonstram limitações na imunidade neonatal que dão ao aumento da suscetibilidade à infecção.
Para estudar a progressão da carga bacteriana e dissecar as respostas imunes protetoras durante a sepse neonatal, desenvolvemos um novo modelo de infecção. Camundongos neonatais nos dias 3-4 da vida são difíceis de injetar no espaço intraperitoneal ou veia da cauda. Em nosso modelo, dia 3 ou 4 filhotes são administrados o inóculo bacteriano ou PBS subcutâneamente na região escárcula. Uma infecção sistêmica desenvolve-se e utilizando e. coli luminescente O1:K1:H7, podemos imagem longitudinalmente de camundongos neonatais individuais para seguir a carga bacteriana disseminada em tecidos periféricos. Este é o primeiro modelo relatado para utilizar imagens intravitais para entender a cinética da disseminação de bactérias durante a sepse em recém-nascidos murinos3.
Aqui, descrevemos um protocolo para induzir infecções sépticas de E. coli em camundongos neonatais3. Descrevemos como preparar o inóculo bacteriano para injeção, e como colher tecido para avaliação da patologia, medição de marcadores inflamatórios por análise de expressão genética e enumeração da carga bacteriana. Além disso, também é descrito o uso de E. coli luminescente para imagens intravitais de recém-nascidos infectados e quantificação da matança bacteriana por células imunes neonatais. Esses protocolos também podem ser adaptados para estudar outras infecções bacterianas importantes em recém-nascidos. Os dados aqui apresentados representam uma nova abordagem geral para a compreensão da dinâmica da infecção em um modelo de sepse neonatal traduzível.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso modelo de infecção subscapular para induzir a sepse bacteriana em camundongos neonatais é um novo método para estudar a disseminação longitudinal de patógenos bacterianos em tempo real. A imagem intravital oferece a oportunidade de explorar a disseminação bacteriana em tempo real em recém-nascidos. Isso é fundamental para entender a cinética da disseminação bacteriana e estudar melhor a resposta e os danos do hospedeiro na fase apropriada da doença. Filhotes de rato são administrados uma injeção s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos institucionais para c.M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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