זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.
ניאונים נמצאים בסיכון מוגבר לאח דם חיידקי בשל הפרופיל החיסוני הייחודי שהם מציגים בחודשים הראשונים לחיים. הקמנו פרוטוקול לחקר הפתוגנזה של E. coli O1:K1:H7, סרוטיפ האחראי לשיעורי תמותה גבוהים בערימות. השיטה שלנו משתמשת בהדמיה תוך-בלתי נמנעת של גורי יילודים בנקודות זמן שונות במהלך התקדמות הזיהום. הדמיה זו, המקבילה למדידת חיידקים בדם, פרופיל דלקתי והיסטופתולוגיה של רקמות, מסמלת גישה קפדנית להבנת דינמיקת הזיהום במהלך אלח דם. בדו”ח הנוכחי, אנו מודל שני inoculums זיהומיות להשוואה של נטל חיידקי וחומרת המחלה. אנו מוצאים כי זיהום תת-שרירי מוביל לזיהום מופץ על ידי 10 שעות לאחר ההדבקה. על ידי 24 שעות, זיהום של זוהר E. coli היה בשפע בדם, ריאות, ורקמות היקפיות אחרות. ביטוי של ציטוקיני דלקתיות בריאות הוא משמעותי ב 24 שעות, וזה ואחריו חדירה תאית וראיות של נזק לרקמות כי עולה עם מינון זיהומיות. להדמיה תוך-ויתית יש כמה מגבלות. זה כולל סף אות זוהר וכמה סיבוכים שיכולים להתעורר עם בירנים במהלך ההרדמה. למרות כמה מגבלות, אנו מוצאים כי מודל הזיהום שלנו מציע תובנה להבנת דינמיקת זיהום אורך במהלך אלח דם מורין יילודים, זה לא נבדק ביסודיות עד כה. אנו מצפים מודל זה יכול להיות מותאם גם ללמוד זיהומים חיידקיים קריטיים אחרים במהלך החיים המוקדמים.
אלח דם חיידקי הוא דאגה משמעותית עבור neonates המציגים פרופיל חיסוני ייחודי בימים הראשונים של החיים שאינו מספק הגנה נאותה מפניזיהום 1. אלח דם יילודים ממשיך להיות בעיה משמעותית בארה”ב. בריאות חשבונאות יותר מ 75,000 מקרים בשנה בארה”בלבדה 2. כדי לחקור את זיהומים אלה לעומק, מודלים חדשניים של בעלי חיים כי recapitulate היבטים של מחלות אנושיות נדרשים. הקמנו מודל זיהום עכבר יילודים באמצעות Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli הוא הגורם המוביל השני של אלח דם יילודים בארה”ב, אבל אחראי על רוב התמותה הקשורים אלחדם 4,5. עם זאת, זוהי הסיבה המובילה כאשר טרום טווח ותינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (VLBW) נחשבים באופן עצמאי5. הסרוטיפ K1 מזוהה לעתים קרובות ביותר עם זיהומים פולשים במחזור הדם ודלקת קרום המוח בneonates 6,7. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפול אחרות מעבר לאנטיביוטיקה וטיפול תומך. בינתיים, שיעורי עמידות לאנטיביוטיקה ממשיכים לעלות עבור חיידקים פתוגניים רבים, עם כמה זנים של E. coli עמידים בפני שפע של אנטיביוטיקה נפוץבטיפול 8. לכן, זה הכרחי כי אנו ממשיכים לייצר שיטות ללמוד את המנגנונים של אלח דם ואת התגובה המארחת ב neonates. תוצאות אלה יכולות לעזור לשפר את הטיפולים הנוכחיים ואת תוצאות הזיהום.
המצב החיסוני של מילים מאופיין בהבדלים פנוטיפיים ותפקודיים בהשוואה למבוגרים. לדוגמה, רמות גבוהות של ציטוקינות אנטי דלקתיות ורגולטוריות, כגון אינטרלוקין (IL)-10 ו IL-27, הוכחו להיות מיוצר על ידי מקרופאגים שמקורם בדם טבור נמצאים ברמות גבוהות יותר בסרום שלניאונטיות מורין 9,10,11. זה עולה בקנה אחד עם רמות נמוכות יותר של IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 ו- TNF-α המדווחים לעתים קרובות מתאים יילודים בהשוואה לעמיתיהםהבוגרים 10. בנוסף, מערכת החיסון של יילודים מוטה לכיוון תגובת תאי T Th2 ורגולציה לעומתמבוגרים 12. מספרים גבוהים של נויטרופילים, תאי T, תאי B, תאי NK ומונוציטים נמצאים גם הם בניבים, אך עם ליקויים תפקודיים משמעותיים. זה כולל פגמים בביטוי של סמני פני תאים והצגת אנטיגן המצביעים עלחוסר בגרות 13,14,15. בנוסף, נויטרופילים יילודים לוקים בחוסר משמעותי ביכולתם לנדוד לגורמים כימוטקטיים16. תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) נמצאים גם הם ברמות גבוהות של יאלואטים והוצג לאחרונה כמקור ל- IL-2711. MDSCs הם מאוד מדכאים כלפי תאי T17. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים מגבלות בחסינות יילודים המלוות רגישות מוגברת לזיהום.
כדי לחקור את התקדמות הנטל החיידקי ול לנתח תגובות חיסוניות מארח מגן במהלך אלח דם יילודים, פיתחנו מודל זיהום חדשני. עכברי יילודים בימים 3-4 של החיים קשה להזריק בחלל תוך-לידתי או וריד הזנב. במודל שלנו, יום 3 או 4 גורים מנוהלים inoculum חיידקי או PBS תת עורית לאזור השעיר לעזאזל. זיהום מערכתי מתפתח באמצעות אור E. coli O1:K1:H7, אנחנו יכולים אורך תמונה עכברים יילודים בודדים כדי לעקוב אחר הנטל החיידקי המופצת ברקמות היקפיות. זהו המודל המדווח הראשון להשתמש הדמיה תוך ואט כדי להבין את הקינטיקה של הפצת חיידקים במהלך אלח דם ב- murine neonates3.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום זיהומים ספיגה E. coli בעכברים יילודים3. אנו מתארים כיצד להכין את אינוקולום החיידקים להזרקה, וכיצד לקצור רקמה להערכת פתולוגיה, מדידת סמנים דלקתיים על ידי ניתוח ביטוי גנים, ו ספירת הנטל החיידקי. בנוסף, מתואר גם השימוש ב- E. coli זוהר להדמיה תוך-בלתי נמנעת של יילודים נגועים וכימות הרג חיידקים על ידי תאי חיסון יילודים. פרוטוקולים אלה עשויים גם להיות מותאמים ללמוד זיהומים חיידקיים חשובים אחרים בוייחומים. הנתונים המוצגים כאן מייצגים גישה חדשנית כוללת להבנת דינמיקת ההדבקה במודל אלח דם יילודים מתתרגם.
מודל הזיהום התת-שרירי שלנו לחידוש אלח דם חיידקי בעכברים יילודים הוא שיטה חדשנית לחקר התפשטות האורך של פתוגנים חיידקיים בזמן אמת. הדמיה תוך-תתיאטרית מספקת את ההזדמנות לחקור הפצת חיידקים בזמן אמת ביאלונדטים. זה קריטי כדי להבין את הקינטיקה של הפצת חיידקים כדי להמשיך לחקור את התגובה המארחת ו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מוסדיות .M.R.
1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |