Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis
Summary
Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.
Abstract
Neonate haben ein erhöhtes Risiko für bakterielle Sepsis aufgrund des einzigartigen Immunprofils, das sie in den ersten Lebensmonaten zeigen. Wir haben ein Protokoll zur Untersuchung der Pathogenese von E. coli O1:K1:H7, einem Serotyp, der für hohe Sterblichkeitsraten bei Neonaten verantwortlich ist, erstellt. Unsere Methode nutzt intravitale Bildgebung von neonatalen Welpen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Fortschreitens der Infektion. Diese Bildgebung, parallel zur Messung von Bakterien im Blut, entzündliche Profilierung und Gewebehistopathologie, bedeutet einen strengen Ansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik während der Sepsis. Im aktuellen Bericht modellieren wir zwei infektiöse Inokulaums zum Vergleich der bakteriellen Belastungen und der Schwere der Krankheit. Wir stellen fest, dass subscapulare Infektion führt zu einer disseminierten Infektion durch 10 h Post-Infektion. Bis 24 h war eine Infektion mit lumineszierendem E. coli im Blut, in der Lunge und anderen peripheren Geweben reichlich vorhanden. Die Expression von entzündlichen Zytokinen in der Lunge ist bei 24 h signifikant, gefolgt von einer zellulären Infiltration und Hinweisen auf Gewebeschäden, die mit der infektiösen Dosis zunehmen. Intravital-Bildgebung hat einige Einschränkungen. Dazu gehören eine leuchtende Signalschwelle und einige Komplikationen, die bei Neonaten während der Anästhesie auftreten können. Trotz einiger Einschränkungen stellen wir fest, dass unser Infektionsmodell einen Einblick bietet, um die Dynamik der Längsinfektion bei neonataler muriner Sepsis zu verstehen, die bis heute nicht gründlich untersucht wurde. Wir erwarten, dass dieses Modell auch angepasst werden kann, um andere kritische bakterielle Infektionen im frühen Leben zu untersuchen.
Introduction
Bakterielle Sepsis ist ein wichtiges Anliegen für Neonate, die ein einzigartiges Immunprofil in den ersten Tagen des Lebens aufweisen, die keinen angemessenen Schutz vorInfektionenbieten 1 . Neonatale Sepsis ist nach wie vor ein erhebliches US-Gesundheitsproblem, das mehr als 75.000 Fälle pro Jahr allein in den USA ausmacht2. Um diese Infektionen eingehend zu untersuchen, sind neuartige Tiermodelle erforderlich, die Aspekte menschlicher Krankheiten rekapitulieren. Wir haben ein neonatales Mausinfektionsmodell mit Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli ist die zweithäufigste Ursache für neonatale Sepsis in den USA, ist aber für die Mehrheit der Sepsis-assoziierten Sterblichkeit4,5verantwortlich. Es ist jedoch die Hauptursache, wenn Vor- und sehr niedrige Geburtsgewicht (VLBW) Babys unabhängig betrachtet werden5. Der K1-Serotyp wird am häufigsten mit invasiven Blutkreislaufinfektionen und Meningitis bei Neonaten6,7in Verbindung gebracht. Derzeit gibt es keine anderen Behandlungsmöglichkeiten als Antibiotika und unterstützende Pflege. In der Zwischenzeit steigen die Antibiotikaresistenzraten für viele pathogene Bakterien weiter an, wobei einige Stämme von E. coli gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent sind, die häufig in der Behandlung verwendet werden8. Daher ist es unerlässlich, dass wir weiterhin Methoden generieren, um die Mechanismen der Sepsis und die Wirtsreaktion in Neonaten zu untersuchen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, aktuelle Behandlungen und Infektionsergebnisse zu verbessern.
Der Immunzustand von Neonaten ist sowohl durch phänotypische als auch funktionelle Unterschiede im Vergleich zu Erwachsenen gekennzeichnet. Zum Beispiel, erhöhte Konzentrationen von entzündungshemmenden und regulatorischen Zytokinen, wie Interleukin (IL)-10 und IL-27, haben gezeigt, dass durch Nabelschnurblut-abgeleitete Makrophagen produziert werden und sind in höheren Konzentrationen im Serum der murinen Neonate9,10,11. Dies stimmt mit niedrigeren IFN-α-, IFN-ɣ-, IL-12- und TNF-α überein, die häufig von neonatalen Zellen im Vergleich zu erwachsenen Pendants berichtet werden10. Darüber hinaus ist das neonatale Immunsystem in Richtung einer Th2 und regulatorischen T-Zell-Antwort im Vergleich zu Erwachsenen12verzerrt. Erhöhte Anzahl von Neutrophilen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten sind auch in Neonaten vorhanden, aber mit erheblichen funktionellen Beeinträchtigungen. Dazu gehören Defekte in der Expression von Zelloberflächenmarkern und Antigendarstellungen, die auf Unreife13,14,15hindeuten. Darüber hinaus sind neonatale Neutrophile signifikant mangelhaft in ihrer Fähigkeit, zu chemotaktischen Faktoren zu migrieren16. Myeloide-abgeleitete Suppressorzellen (MDSCs) sind auch auf erhöhten Niveaus in Neonaten gefunden und vor kurzem gezeigt, dass eine Quelle von IL-2711. MDSCs sind gegenüber T-Zellen17stark unterdrückend. Zusammen zeigen diese Daten Einschränkungen der neonatalen Immunität, die eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen verleihen.
Um das Fortschreiten der bakteriellen Belastung zu untersuchen und schützende Wirtsimmunreaktionen während einer neonatalen Sepsis zu sezieren, haben wir ein neuartiges Infektionsmodell entwickelt. Neonatale Mäuse an den Tagen 3-4 des Lebens sind schwierig, in den intraperitonealen Raum oder Schwanz Vene zu injizieren. In unserem Modell werden Tag 3 oder 4 Welpen das bakterielle inokulum oder PBS subkutan in den Skapulierbereich verabreicht. Eine systemische Infektion entwickelt sich und mit lumineszierenden E. coli O1:K1:H7 können wir einzelne neonatale Mäuse längs abbilden, um der verbreiteten bakteriellen Belastung in peripheren Geweben zu folgen. Dies ist das erste gemeldete Modell, um intravitale Bildgebung zu nutzen, um die Kinetik der Verbreitung von Bakterien während der Sepsis in murinen Neonaten zu verstehen3.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induzieren septischer E. coli-Infektionen bei neonatalen Mäusen3. Wir beschreiben, wie man das bakterielle Inokulum für die Injektion vorbereitet und wie man Gewebe für die Beurteilung der Pathologie, die Messung von Entzündungsmarkern durch Genexpressionsanalyse und die Aufzählung der bakteriellen Belastung erntet. Darüber hinaus wird die Verwendung von lumineszierendem E. coli für die intravitale Bildgebung infizierter Neugeborenen und die Quantifizierung der bakteriellen Tötung durch neonatale Immunzellen beschrieben. Diese Protokolle können auch angepasst werden, um andere wichtige bakterielle Infektionen bei Neonaten zu untersuchen. Die hier vorgestellten Daten stellen einen neuartigen Gesamtansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik in einem übersetzbaren neonatalen Sepsismodell dar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser subskapulares Infektionsmodell zur Induktion von bakteriellen Sepsis bei neonatalen Mäusen ist eine neuartige Methode, um die Längsausbreitung bakterieller Krankheitserreger in Echtzeit zu untersuchen. Intravital-Bildgebung bietet die Möglichkeit, die bakterielle Verbreitung in Echtzeit in Neonaten zu erforschen. Dies ist entscheidend, um die Kinetik der bakteriellen Verbreitung zu verstehen und die Reaktion und den Schaden des Wirts in der entsprechenden Krankheitsphase weiter zu untersuchen. Mauswelpen wird ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch institutionelle Mittel an C.M.R. unterstützt.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
