نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام
Summary
عدوى الفئران حديثي الولادة مع الإنارة الحيوية E. القولونية O1:K1:H7 يؤدي إلى عدوى الصرف الصحي مع التهاب رئوي كبير وأمراض الرئة. هنا، نحن وصف إجراءات لنموذج ومواصلة دراسة الإنتان الوليد باستخدام التصوير داخل الرحم الطولي بالتوازي مع تعداد الأعباء البكتيرية النظامية، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الرئوية.
Abstract
يتعرض الولدان لخطر متزايد للإصابة بالإنتان البكتيري بسبب الملامح المناعية الفريدة التي يعرضونها في الأشهر الأولى من الحياة. لقد أنشأنا بروتوكولا لدراسة التسبب في الإمراض من E. القولونية O1:K1:H7، وهو نوع المصلي المسؤول عن ارتفاع معدلات الوفيات لدى الأطفال حديثي الولادة. تستخدم طريقتنا التصوير داخل الرحم للجراء الوليدية في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطور العدوى. هذا التصوير، بالتوازي مع قياس البكتيريا في الدم، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الأنسجة، يدل على نهج صارم لفهم ديناميات العدوى أثناء الإنتان. في هذا التقرير، نحن نموذج اثنين من inoculums المعدية للمقارنة بين الأعباء البكتيرية وشدة المرض. نجد أن العدوى تحت الكتف تؤدي إلى العدوى التي تنتشر من قبل 10 ح بعد العدوى. بواسطة 24 ساعة، عدوى الإشريكية القولونية الإنارة كانت وفيرة في الدم والرئتين والأنسجة الطرفية الأخرى. التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في الرئتين مهم في 24 ساعة ، ويتبع ذلك تسلل خلوي ودليل على تلف الأنسجة يزيد مع الجرعة المعدية. التصوير داخل الرحم لديه بعض القيود. وهذا يشمل عتبة إشارة الإنارة وبعض المضاعفات التي يمكن أن تنشأ مع حديثي الولادة أثناء التخدير. على الرغم من بعض القيود، نجد أن نموذج العدوى لدينا يقدم نظرة ثاقبة لفهم ديناميات العدوى الطولية خلال تعفن الرحم الوليد، التي لم يتم فحصها بدقة حتى الآن. ونتوقع أيضا أن يتم تكييف هذا النموذج لدراسة الالتهابات البكتيرية الحرجة الأخرى خلال الحياة المبكرة.
Introduction
تعفن الدم البكتيري هو مصدر قلق كبير لحديثي الولادة التي تظهر صورة مناعية فريدة في الأيام الأولى من الحياة التي لا توفر الحماية الكافية من العدوى1. لا يزال الإنتان الوليدي مشكلة كبيرة في الرعاية الصحية في الولايات المتحدة تمثل أكبر من 75,000 حالة سنويًا في الولايات المتحدة وحدها2. لدراسة هذه العدوى في العمق، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية جديدة تُكاب في أشكال من أمراض الإنسان. لقد أنشأنا نموذج عدوى الماوس الوليدية باستخدام Escherichia القولونية، O1:K1:H73. الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي الثاني لتعفن الدم الوليدي في الولايات المتحدة، ولكنها مسؤولة عن غالبية الوفيات المرتبطة بالإنتان4،5. ومع ذلك، هو السبب الرئيسي عندما قبل المدى وانخفاض جدا الوزن عند الولادة (VLBW) تعتبر الأطفال بشكل مستقل5. ويرتبط النمط المصلي K1 في كثير من الأحيان مع التهابات مجرى الدم الغازية والتهاب السحايا في الأطفال حديثي الولادة6,7. ولا توجد حالياً خيارات علاجية أخرى تتجاوز المضادات الحيوية والرعاية الداعمة. وفي الوقت نفسه، معدلات مقاومة المضادات الحيوية لا تزال ترتفع بالنسبة للعديد من البكتيريا المسببة للأمراض، مع بعض سلالات الإشريكية مقاومة للعديد من المضادات الحيوية المستخدمة عادة في العلاج8. وبالتالي، من الضروري أن نستمر في توليد طرق لدراسة آليات الإنتان واستجابة المضيف في حديثي الولادة. يمكن أن تساعد هذه النتائج على تحسين العلاجات الحالية ونتائج العدوى.
تتميز الحالة المناعية لحديثي الولادة باختلافات ظاهرية ووظيفية مقارنةً بالبالغين. على سبيل المثال، وقد ثبت أن مستويات مرتفعة من مضادة للالتهابات والسيكوكاينات، مثل interleukin (IL)-10 و IL-27، التي تنتجها الضامة المستمدة من دم الحبل السري، وهي موجودة في مستويات أكبر في مصل حديثي الولادة مورين9،10،11. وهذا يتسق مع انخفاض مستويات IFN-α، IFN-ɣ، IL-12، و TNF-α التي يتم الإبلاغ عنها بشكل متكرر من خلايا حديثي الولادة مقارنة مع نظرائهم البالغين10. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجهاز المناعي الوليدي منحرف نحو استجابة الخلايا التائية Th2 والتنظيمية مقارنةً بـبالغين12. كما توجد أعداد مرتفعة من العدلات والخلايا التائية والخلايا ب وخلايا NK والخلايا أحادية الخلايا في المواليد الجدد، ولكن مع إعاقات وظيفية كبيرة. وهذا يشمل عيوب في التعبير عن علامات سطح الخلية وعرض المستضد التي تشير إلى عدم النضج13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، العدلات الوليدية تعاني من نقص كبير في قدرتها على الهجرة إلى العوامل الكيميائية16. كما تم العثور على خلايا القامع النخاعية المشتقة (MDSCs) في مستويات مرتفعة في حديثي الولادة وتبين مؤخرا أن يكون مصدرا لل IL-2711. MDSCs هي قمع شديد تجاه الخلايا T17. وبشكل جماعي، تُظهر هذه البيانات أوجه قصور في مناعة الولدان التي تزيد من قابلية الإصابة بالعدوى.
لدراسة تطور العبء البكتيري وتشريح الاستجابات المناعية المضيفة الواقية أثناء الإنتان الوليدي ، قمنا بتطوير نموذج عدوى جديد. الفئران الوليدية في الأيام 3-4 من الحياة من الصعب حقن في الفضاء داخل الصفاق أو الوريد الذيل. في نموذجنا ، يتم إعطاء اليوم 3 أو 4 الجراء في البكتيريا inoculum أو PBS تحت الجلد في المنطقة الكتف. تطور العدوى الجهازية واستخدام الإنارة الإشريكية القولونية O1:K1:H7، يمكننا تصوير فئران حديثي الولادة الفردية بشكل طولي لمتابعة العبء البكتيري المنشور في الأنسجة الطرفية. هذا هو أول نموذج يتم الإبلاغ عنه للاستفادة من التصوير داخل الرحم لفهم حركية انتشار البكتيريا أثناء الإنتان في المواليد3المورين .
هنا، نحن وصف بروتوكول للحث على التهابات الإشريكية القولونية في الفئران حديثي الولادة3. نحن نُصف كيفية تحضير الحقن البكتيري للحقن، وكيفية حصاد الأنسجة لتقييم علم الأمراض، وقياس العلامات الالتهابية عن طريق تحليل التعبير الجيني، و تعداد العبء البكتيري. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام الإشريكية الإشريكية الإشريكية (E. coli) للتصوير داخل الرحم للمواليد المصابين وتحديد كمية القتل البكتيري من قبل الخلايا المناعية الوليدية. ويمكن أيضاً تكييف هذه البروتوكولات لدراسة التهابات بكتيرية مهمة أخرى لدى الولدان. تمثل البيانات المعروضة هنا منهجًا جديدًا عامًا لفهم ديناميكيات العدوى في نموذج الإنتان الوليدي القابل للترجمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج العدوى تحت كابيكال لدينا لتحفيز تعفن البكتيريا في الفئران حديثي الولادة هو طريقة جديدة لدراسة الانتشار الطولي للمسببات البكتيرية في الوقت الحقيقي. يوفر التصوير داخل الرحم الفرصة لاستكشاف الانتشار البكتيري في الوقت الحقيقي في حديثي الولادة. وهذا أمر بالغ الأهمية لفهم حركية الانتش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل صناديق مؤسسية إلى C.M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
