Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1
Summary
Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.
Abstract
O sorotipo 1 do Streptococcus pneumoniae continua sendo um enorme problema em países de baixa e média renda, particularmente na África Subsaariana. Apesar de sua importância, os estudos nesse sorotipo têm sido dificultados pela falta de ferramentas genéticas para modificá-lo. Neste estudo, descrevemos um método para modificar geneticamente um isolado clínico do sorotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, isso foi conseguido explorando a capacidade do pneumococo de adquirir DNA naturalmente. No entanto, ao contrário da maioria dos pneumococos, o uso de DNA linear não foi bem sucedido; para mutar essa importante cepa, um plasmídeo suicida teve que ser usado. Essa metodologia forneceu os meios para uma compreensão mais profunda desse sorotipo indescritível, tanto em termos de biologia quanto de patogenicidade. Para validar o método, a principal toxina pneumocócica conhecida, a pneumolisina, sofreu mutação por ter um fenótipo bem conhecido e fácil de seguir. Mostramos que o mutante, como esperado, perdeu sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos. Ao sermos capazes de mutar um gene importante no sorotipo de interesse, pudemos observar fenótipos diferentes para a perda de função mutantes em infecções intraperitoneais e intranasais daqueles observados para outros sorotipos. Em resumo, este estudo prova que a estirpe 519/43 (serotipo 1) pode ser geneticamente modificada.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, o pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Até recentemente, cerca de 100 sorotipos de S. pneumoniae foram descobertos 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, a doença pneumocócica invasiva (DPI) reivindica cerca de 700.000 mortes, de crianças menores de 5 anos8. S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana, otite média, meningite e septicemia em todo o mundo9.
No cinturão africano de meningite, o sorotipo 1 é responsável por surtos de meningite, onde o tipo de sequência (ST) ST217, um tipo de sequência extremamente virulento, é dominante 10,11,12,13,14,15. Sua importância na patologia da meningite tem sido comparada à de Neisseria meningitidis no cinturão africano de meningite16. O sorotipo 1 é frequentemente a principal causa de DPI; no entanto, é muito raramente encontrado em carruagens. De fato, na Gâmbia, esse sorotipo é responsável por 20% de todas as doenças invasivas, mas só foi encontrado em 0,5% dos portadores saudáveis14,17,18,19. A troca genética e a recombinação em pneumococos competentes ocorrem geralmente no transporte e não na doença invasiva20. Além disso, o sorotipo 1 demonstrou ter uma das taxas de transporte mais curtas descritas entre os pneumococos (apenas 9 dias). Portanto, tem sido proposto que esse sorotipo pode ter uma taxa de recombinação muito menor do que outros21.
Estudos aprofundados são necessários para entender a razão por trás da baixa taxa de transporte das cepas do sorotipo 1 e sua importância na doença invasiva na África Subsaariana.
Aqui relatamos um protocolo que permite a mutagênese em todo o genoma de uma cepa específica do sorotipo 1, 519/43. Esta estirpe pode facilmente adquirir e recombinar novo ADN no seu genoma. Este método ainda não é inter-tensão, mas é muito eficiente quando feito em fundo 519/43 (outros alvos foram mutados, manuscritos em preparação). Simplesmente usando a cepa 519/43 e explorando sua competência natural, bem como substituindo a maneira como o DNA exógeno é fornecido, fomos capazes de mutar o gene da pneumolisina (ply) nesta cepa do sorotipo 1. Esse método representa uma melhoria em relação ao apresentado por Harvey et al.22 , pois é feito em uma única etapa, sem a necessidade de passar o DNA por um sorotipo diferente. No entanto, e devido à variabilidade entre as cepas, nenhum método foi padronizado para todas as cepas. A capacidade de mutar genes específicos e observar seus efeitos permitirá uma compreensão profunda das cepas de S. pneumoniae do sorotipo 1 e fornecerá respostas para o papel dessas cepas na meningite na África Subsaariana.
Protocol
Representative Results
Discussion
O Streptococcus pneumoniae, em particular o sorotipo 1, continua a ser uma ameaça global que causa doença pneumocócica invasiva e meningite. Apesar da introdução de várias vacinas que deveriam ser protetoras contra o sorotipo 1, na África, esse sorotipo ainda é capaz de causar surtos que levam a alta morbidade e mortalidade13. A capacidade de manipular geneticamente este sorotipo é de importância crítica devido à sua relevância clínica. O método descrito neste estudo permit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Meningitis Trust e ao MRC por fornecerem financiamento para este trabalho.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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