Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43
Summary
Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).
Abstract
Il sierotipo 1 di Streptococcus pneumoniae rimane un problema enorme nei paesi a basso e medio reddito, in particolare nell’Africa sub-sahariana. Nonostante la sua importanza, gli studi su questo sierotipo sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti genetici per modificarlo. In questo studio, descriviamo un metodo per modificare geneticamente un isolato clinico del sierotipo 1 (ceppo 519/43). È interessante notare che questo è stato ottenuto sfruttando la capacità dello Pneumococco di acquisire naturalmente il DNA. Tuttavia, a differenza della maggior parte degli pneumococchi, l’uso del DNA lineare non ha avuto successo; Per mutare questo importante ceppo, è stato necessario utilizzare un plasmide suicida. Questa metodologia ha fornito i mezzi per una comprensione più profonda di questo sierotipo elusivo, sia in termini di biologia che di patogenicità. Per convalidare il metodo, la principale tossina pneumococcica conosciuta, la pneumolisina, è stata mutata perché ha un fenotipo ben noto e facile da seguire. Abbiamo dimostrato che il mutante, come previsto, ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi. Essendo in grado di mutare un gene importante nel sierotipo di interesse, siamo stati in grado di osservare diversi fenotipi per la perdita di funzione mutanti su infezioni intraperitoneali e intranasali da quelli osservati per altri sierotipi. In sintesi, questo studio dimostra che il ceppo 519/43 (sierotipo 1) può essere geneticamente modificato.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello globale. Fino a poco tempo fa, sono stati scoperti quasi 100 sierotipi di S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ogni anno, la malattia pneumococcica invasiva (IPD) rivendica circa 700.000 decessi, di bambini di età inferiore ai 5 anni8. S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica, otite media, meningite e setticemia in tutto il mondo9.
Nella cintura africana della meningite, il sierotipo 1 è responsabile delle epidemie di meningite, dove il tipo di sequenza (ST) ST217, un tipo di sequenza estremamente virulento, è dominante 10,11,12,13,14,15. La sua importanza nella patologia della meningite è stata paragonata a quella di Neisseria meningitidis nella cintura africana della meningite16. Il sierotipo 1 è spesso la causa principale dell’IPD; tuttavia, si trova molto raramente in carrozza. Infatti, in Gambia, questo sierotipo è responsabile del 20% di tutte le malattie invasive, ma è stato trovato solo nello 0,5% dei portatori sani14,17,18,19. Lo scambio genetico e la ricombinazione negli pneumococchi competenti avvengono generalmente nel trasporto piuttosto che nella malattia invasiva20. Inoltre, il sierotipo 1 ha dimostrato di avere uno dei tassi di trasporto più brevi descritti tra gli pneumococchi (solo 9 giorni). Pertanto, è stato proposto che questo sierotipo potrebbe avere un tasso di ricombinazione molto più basso rispetto ad altri21.
Sono necessari studi approfonditi per comprendere il motivo del basso tasso di trasporto dei ceppi del sierotipo 1 e la sua importanza nelle malattie invasive nell’Africa sub-sahariana.
Qui riportiamo un protocollo che consente la mutagenesi genome-wide di un particolare ceppo di sierotipo 1, 519/43. Questo ceppo può facilmente acquisire e ricombinare nuovo DNA nel suo genoma. Questo metodo non è ancora inter-sforzo, ma è molto efficiente se fatto in background 519/43 (altri obiettivi sono stati mutati, manoscritti in preparazione). Semplicemente utilizzando il ceppo 519/43 e sfruttando la sua competenza naturale, oltre a sostituire il modo in cui viene fornito il DNA esogeno, siamo stati in grado di mutare il gene della pneumolisina (ply) in questo ceppo sierotipo 1. Questo metodo rappresenta un miglioramento rispetto a quello presentato da Harvey et al.22 in quanto viene fatto in un unico passaggio senza la necessità di far passare il DNA attraverso un sierotipo diverso. Tuttavia, e a causa della variabilità tra i ceppi, nessun metodo è stato standardizzato per tutti i ceppi. La capacità di mutare geni specifici e osservarne gli effetti permetterà una profonda comprensione dei ceppi di sierotipo 1 S. pneumoniae e fornirà risposte per il ruolo di questi ceppi nella meningite nell’Africa sub-sahariana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, in particolare il sierotipo 1, continua ad essere una minaccia globale che causa malattie invasive da pneumococco e meningite. Nonostante l’introduzione di vari vaccini che dovrebbero essere protettivi contro il sierotipo 1, in Africa, questo sierotipo è ancora in grado di causare epidemie che portano ad alta morbilità e mortalità13. La capacità di manipolare geneticamente questo sierotipo è di fondamentale importanza a causa della sua rilevanza clinica. Il …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Meningitis Trust e il MRC per aver fornito finanziamenti per questo lavoro.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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