Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43
Summary
Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.
Abstract
Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 ist nach wie vor ein großes Problem in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, insbesondere in Afrika südlich der Sahara. Trotz seiner Bedeutung wurden Studien zu diesem Serotyp durch den Mangel an genetischen Werkzeugen behindert, um ihn zu modifizieren. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur genetischen Modifikation eines klinischen Serotyp-1-Isolats (Stamm 519/43). Interessanterweise wurde dies erreicht, indem die Fähigkeit der Pneumokokken ausgenutzt wurde, DNA auf natürliche Weise zu erwerben. Im Gegensatz zu den meisten Pneumokokken war die Verwendung von linearer DNA jedoch nicht erfolgreich; Um diesen wichtigen Stamm zu mutieren, musste ein Selbstmord-Plasmid verwendet werden. Diese Methodik hat die Mittel für ein tieferes Verständnis dieses schwer fassbaren Serotyps geschaffen, sowohl in Bezug auf seine Biologie als auch auf seine Pathogenität. Um die Methode zu validieren, wurde das wichtigste bekannte Pneumokokken-Toxin, Pneumolysin, mutiert, da es einen bekannten und leicht zu verfolgenden Phänotyp aufweist. Wir zeigten, dass die Mutante erwartungsgemäß ihre Fähigkeit verlor, rote Blutkörperchen zu lysieren. Indem wir in der Lage waren, ein wichtiges Gen im interessierenden Serotyp zu mutieren, konnten wir verschiedene Phänotypen für Funktionsverlustmutanten bei intraperitonealen und intranasalen Infektionen beobachten, die für andere Serotypen beobachtet wurden. Zusammenfassend belegt diese Studie, dass der Stamm 519/43 (Serotyp 1) genetisch verändert werden kann.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, der Pneumokokkus) ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Bis vor kurzem wurden fast 100 Serotypen von S. pneumoniae entdeckt 1,2,3,4,5,6,7. Jährlich sterben rund 700.000 Kinder unter 5 Jahrenan der invasiven Pneumokokkenerkrankung (IPD) 8. S. pneumoniae ist weltweit die Hauptursache für bakterielle Pneumonie, Mittelohrentzündung, Meningitis und Septikämie9.
Im afrikanischen Meningitis-Gürtel ist Serotyp 1 für Meningitis-Ausbrüche verantwortlich, bei denen der Sequenztyp (ST) ST217, ein extrem virulenter Sequenztyp, 10,11,12,13,14,15 dominant ist. Seine Bedeutung in der Meningitis-Pathologie wurde mit der von Neisseria meningitidis im afrikanischen Meningitis-Gürtelverglichen 16. Serotyp 1 ist oft die Hauptursache für IPD; Es ist jedoch sehr selten in der Kutsche zu finden. Tatsächlich ist dieser Serotyp in Gambia für 20% aller invasiven Erkrankungen verantwortlich, wurde jedoch nur bei 0,5% der gesunden Träger gefunden14,17,18,19. Genetischer Austausch und Rekombination in kompetenten Pneumokokken erfolgt im Allgemeinen eher bei der Beförderung als bei invasiven Erkrankungen20. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Serotyp 1 eine der kürzesten Trageraten aufweist, die bei Pneumokokken beschrieben wurden (nur 9 Tage). Daher wurde vorgeschlagen, dass dieser Serotyp eine viel niedrigere Rekombinationsrate aufweisen könnte als andere21.
Eingehende Studien sind notwendig, um den Grund für die niedrige Beförderungsrate von Serotyp-1-Stämmen und ihre Bedeutung für invasive Erkrankungen in Afrika südlich der Sahara zu verstehen.
Hier berichten wir über ein Protokoll, das eine genomweite Mutagenese eines bestimmten Serotyp-1-Stammes ermöglicht, 519/43. Dieser Stamm kann leicht neue DNA erwerben und in sein Genom rekombinieren. Diese Methode ist noch nicht übergreifend, aber sie ist sehr effizient, wenn sie im 519/43-Hintergrund durchgeführt wird (andere Ziele wurden mutiert, Manuskripte sind in Vorbereitung). Durch die einfache Verwendung des 519/43-Stammes und die Nutzung seiner natürlichen Kompetenz sowie die Substitution der Art und Weise, wie die exogene DNA bereitgestellt wird, konnten wir das Pneumolysin-Gen (ply) in diesem Serotyp-1-Stamm mutieren. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber der von Harvey et al.22 vorgestellten Methode dar, da sie in einem Schritt durchgeführt wird, ohne dass die DNA durch einen anderen Serotyp geleitet werden muss. Nichtsdestotrotz und aufgrund der Variabilität zwischen den Stämmen wurde keine Methode für alle Stämme standardisiert. Die Fähigkeit, bestimmte Gene zu mutieren und ihre Auswirkungen zu beobachten, wird ein tiefgreifendes Verständnis der Serotyp 1 S. pneumoniae-Stämme ermöglichen und Antworten auf die Rolle dieser Stämme bei Meningitis in Afrika südlich der Sahara liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, insbesondere Serotyp 1, ist nach wie vor eine globale Bedrohung, die invasive Pneumokokkenerkrankungen und Meningitis verursacht. Trotz der Einführung verschiedener Impfstoffe, die vor Serotyp 1 schützen sollten, ist dieser Serotyp in Afrika immer noch in der Lage, Ausbrüche zu verursachen, die zu einer hohen Morbidität und Mortalität führen13. Die Fähigkeit, diesen Serotyp genetisch zu manipulieren, ist aufgrund seiner klinischen Relevanz von entscheidend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Meningitis Trust und dem MRC für die Finanzierung dieser Arbeit.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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