Construction de mutants dans la souche 519/43 de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1
Summary
Ici, nous décrivons une souche 519/43 de sérotype 1 de S. pneumoniae qui peut être génétiquement modifiée en utilisant sa capacité à acquérir naturellement de l’ADN et un plasmide suicide. Comme preuve de principe, un mutant isogénique dans le gène de la pneumolysine (pli) a été fabriqué.
Abstract
Streptococcus pneumoniae sérotype 1 reste un énorme problème dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, en particulier en Afrique subsaharienne. Malgré son importance, les études sur ce sérotype ont été entravées par le manque d’outils génétiques pour le modifier. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement un isolat clinique de sérotype 1 (souche 519/43). Fait intéressant, cela a été réalisé en exploitant la capacité du pneumocoque à acquérir naturellement de l’ADN. Cependant, contrairement à la plupart des pneumocoques, l’utilisation de l’ADN linéaire n’a pas été couronnée de succès; Pour muter cette souche importante, un plasmide suicide a dû être utilisé. Cette méthodologie a permis de mieux comprendre ce sérotype insaisissable, tant sur le plan biologique que pathogénique. Pour valider la méthode, la principale toxine pneumococcique connue, la pneumolysine, a été mutée car elle a un phénotype bien connu et facile à suivre. Nous avons montré que le mutant, comme prévu, a perdu sa capacité à lyser les globules rouges. En étant capable de muter un gène important dans le sérotype d’intérêt, nous avons pu observer différents phénotypes de mutants de perte de fonction sur les infections intrapéritonéales et intranasales de ceux observés pour d’autres sérotypes. En résumé, cette étude prouve que la souche 519/43 (sérotype 1) peut être génétiquement modifiée.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, le pneumocoque) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Jusqu’à récemment, près de 100 sérotypes de S. pneumoniae ont été découverts 1,2,3,4,5,6,7. Chaque année, les pneumococcies invasives (IIP) font environ 700 000 morts chez les enfants de moins de 5 ans8. S. pneumoniae est la principale cause de pneumonie bactérienne, d’otite moyenne, de méningite et de septicémie dans le monde9.
Dans la ceinture africaine de la méningite, le sérotype 1 est responsable des flambées de méningite, où le type de séquence (ST) ST217, un type de séquence extrêmement virulent, est dominant 10,11,12,13,14,15. Son importance dans la pathologie de la méningite a été comparée à celle de Neisseria meningitidis dans la ceinture africaine de la méningite16. Le sérotype 1 est souvent la principale cause des IIP; Cependant, on le trouve très rarement en voiture. En fait, en Gambie, ce sérotype est responsable de 20% de toutes les maladies invasives, mais il n’a été trouvé que chez 0,5% des porteurs sains14,17,18,19. L’échange génétique et la recombinaison chez les pneumocoques compétents se produisent généralement en portage plutôt qu’en cas de maladie invasive20. De plus, il a été démontré que le sérotype 1 a l’un des taux de portage les plus courts décrits parmi les pneumocoques (seulement 9 jours). Par conséquent, il a été proposé que ce sérotype pourrait avoir un taux de recombinaison beaucoup plus faible que les autres21.
Des études approfondies sont nécessaires pour comprendre la raison du faible taux de portage des souches de sérotype 1 et son importance dans les maladies invasives en Afrique subsaharienne.
Nous rapportons ici un protocole qui permet la mutagénèse pangénomique d’une souche particulière de sérotype 1, 519/43. Cette souche peut facilement acquérir et recombiner un nouvel ADN dans son génome. Cette méthode n’est pas encore inter-déformation, mais elle est très efficace lorsqu’elle est réalisée en fond 519/43 (d’autres cibles ont été mutées, des manuscrits en préparation). En utilisant simplement la souche 519/43, en exploitant sa compétence naturelle, ainsi qu’en substituant la façon dont l’ADN exogène est fourni, nous avons pu muter le gène de la pneumolysine (pli) dans cette souche de sérotype 1. Cette méthode représente une amélioration par rapport à celle présentée par Harvey et coll.22 , car elle se fait en une seule étape sans qu’il soit nécessaire de faire passer l’ADN par un sérotype différent. Néanmoins, et en raison de la variabilité inter-déformation, aucune méthode n’a été normalisée pour toutes les souches. La capacité de muter des gènes spécifiques et d’observer ses effets permettra une compréhension approfondie des souches de S. pneumoniae de sérotype 1 et fournira des réponses sur le rôle de ces souches dans la méningite en Afrique subsaharienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, en particulier le sérotype 1, continue d’être une menace mondiale causant des pneumococcies invasives et la méningite. Malgré l’introduction de divers vaccins qui devraient protéger contre le sérotype 1, en Afrique, ce sérotype est encore capable de provoquer des épidémies entraînant une morbidité et une mortalité élevées13. La capacité de manipuler génétiquement ce sérotype est d’une importance cruciale en raison de sa pertinence clinique…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Meningitis Trust et le MRC d’avoir financé ce travail.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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