Constructing Mutanten in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae stam 519/43
Summary
Hier beschrijven we een S. pneumoniae serotype 1 stam 519/43 die genetisch kan worden gemodificeerd door gebruik te maken van zijn vermogen om op natuurlijke wijze DNA en een zelfmoordplasmide te verkrijgen. Als proof of principle werd een isogene mutant in het pneumolysine (ply) gen gemaakt.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotype 1 blijft een groot probleem in lage- en middeninkomenslanden, met name in Afrika ten zuiden van de Sahara. Ondanks het belang ervan zijn studies in dit serotype belemmerd door het gebrek aan genetische hulpmiddelen om het te wijzigen. In deze studie beschrijven we een methode om een serotype 1 klinisch isolaat (stam 519/43) genetisch te modificeren. Interessant is dat dit werd bereikt door gebruik te maken van het vermogen van de Pneumokokken om op natuurlijke wijze DNA te verkrijgen. In tegenstelling tot de meeste pneumokokken was het gebruik van lineair DNA echter niet succesvol; Om deze belangrijke stam te muteren, moest een zelfmoordplasmide worden gebruikt. Deze methodologie heeft de middelen verschaft voor een dieper begrip van dit ongrijpbare serotype, zowel in termen van biologie als pathogeniciteit. Om de methode te valideren, werd het belangrijkste bekende pneumokokkentoxine, pneumolysine, gemuteerd omdat het een bekend en gemakkelijk te volgen fenotype heeft. We toonden aan dat de mutant, zoals verwacht, zijn vermogen verloor om rode bloedcellen te lyseren. Door een belangrijk gen in het serotype van belang te kunnen muteren, waren we in staat om verschillende fenotypes te observeren voor functieverlies mutanten bij intraperitoneale en intranasale infecties van die waargenomen voor andere serotypen. Samenvattend bewijst deze studie dat stam 519/43 (serotype 1) genetisch gemodificeerd kan worden.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, de pneumokok) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit. Tot voor kort zijn bijna 100 serotypen van S. pneumoniae ontdekt 1,2,3,4,5,6,7. Jaarlijks claimt invasieve pneumokokkenziekte (IPD) ongeveer 700.000 sterfgevallen, van kinderen jonger dan 5 jaar8. S. pneumoniae is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële longontsteking, otitis media, meningitis en septikemie9.
In de Afrikaanse meningitisgordel is serotype 1 verantwoordelijk voor uitbraken van meningitis, waarbij sequentietype (ST) ST217, een extreem virulent sequentietype, dominant is 10,11,12,13,14,15. Het belang ervan in de meningitispathologie is vergeleken met dat van Neisseria meningitidis in de Afrikaanse meningitisgordel16. Serotype 1 is vaak de belangrijkste oorzaak van IPD; het wordt echter zeer zelden aangetroffen in het rijtuig. In Gambia is dit serotype verantwoordelijk voor 20% van alle invasieve ziekten, maar het werd slechts gevonden bij 0,5% van de gezonde dragers14,17,18,19. Genetische uitwisseling en recombinatie bij competente pneumokokken vindt over het algemeen plaats in het vervoer in plaats van bij invasieve ziekte20. Bovendien is aangetoond dat serotype 1 een van de kortste vervoerssnelheden heeft die worden beschreven onder pneumokokken (slechts 9 dagen). Daarom is voorgesteld dat dit serotype een veel lager recombinatiepercentage zou kunnen hebben dan andere21.
Diepgaande studies zijn nodig om de reden achter de lage transportsnelheid van serotype 1-stammen en het belang ervan bij invasieve ziekten in Afrika ten zuiden van de Sahara te begrijpen.
Hier rapporteren we een protocol dat genoombrede mutagenese van een bepaalde serotype 1-stam mogelijk maakt, 519/43. Deze stam kan gemakkelijk nieuw DNA verwerven en recombineren in zijn genoom. Deze methode is nog niet inter-strain, maar het is zeer efficiënt wanneer het wordt gedaan in 519/43 achtergrond (andere doelen zijn gemuteerd, manuscripten in voorbereiding). Door simpelweg de 519/43-stam te gebruiken en de natuurlijke competentie ervan te benutten, evenals de manier waarop het exogene DNA wordt verstrekt, te vervangen, waren we in staat om het pneumolysine-gen (ply) in deze serotype 1-stam te muteren. Deze methode vertegenwoordigt een verbetering ten opzichte van die gepresenteerd door Harvey et al.22 , omdat het in één stap wordt gedaan zonder de noodzaak om het DNA door een ander serotype te laten gaan. Niettemin, en als gevolg van inter-strain variabiliteit, is er geen methode gestandaardiseerd voor alle stammen. Het vermogen om specifieke genen te muteren en de effecten ervan te observeren, zal een diepgaand begrip van serotype 1 S. pneumoniae-stammen mogelijk maken en het zal antwoorden bieden op de rol van deze stammen in meningitis in Afrika ten zuiden van de Sahara.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, in het bijzonder serotype 1, blijft een wereldwijde bedreiging die invasieve pneumokokkenziekte en meningitis veroorzaakt. Ondanks de introductie van verschillende vaccins die beschermend zouden moeten zijn tegen serotype 1, is dit serotype in Afrika nog steeds in staat om uitbraken te veroorzaken die leiden tot hoge morbiditeit en mortaliteit13. Het vermogen om dit serotype genetisch te manipuleren is van cruciaal belang vanwege de klinische relevantie ervan. De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de Meningitis Trust en de MRC bedanken voor het verstrekken van financiering voor dit werk.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. . Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
