بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43
Summary
هنا ، نصف سلالة S. pneumoniae من النمط المصلي 1 519/43 التي يمكن تعديلها وراثيا باستخدام قدرتها على الحصول بشكل طبيعي على الحمض النووي والبلازميد الانتحاري. كدليل على المبدأ ، تم إجراء طفرة متجانسة في جين pneumolysin (رقائق).
Abstract
لا يزال النمط المصلي 1 للمكورات العقدية الرئوية يمثل مشكلة كبيرة في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، ولا سيما في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. على الرغم من أهميته ، فقد أعيقت الدراسات في هذا النمط المصلي بسبب عدم وجود أدوات وراثية لتعديله. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتعديل العزلة السريرية من النمط المصلي 1 وراثيا (السلالة 519/43). ومن المثير للاهتمام ، تم تحقيق ذلك من خلال استغلال قدرة المكورات الرئوية على اكتساب الحمض النووي بشكل طبيعي. ومع ذلك ، على عكس معظم المكورات الرئوية ، لم يكن استخدام الحمض النووي الخطي ناجحا. لتحور هذه السلالة المهمة ، كان لا بد من استخدام بلازميد انتحاري. وقد وفرت هذه المنهجية الوسائل لفهم أعمق لهذا النمط المصلي المراوغ ، سواء من حيث بيولوجيته أو إمراضيته. للتحقق من صحة الطريقة ، تم تحور سم المكورات الرئوية الرئيسي المعروف ، pneumolysin ، لأنه يحتوي على نمط ظاهري معروف وسهل المتابعة. أظهرنا أن المتحور ، كما هو متوقع ، فقد قدرته على تحلل خلايا الدم الحمراء. من خلال القدرة على تحور جين مهم في النمط المصلي محل الاهتمام ، تمكنا من ملاحظة أنماط ظاهرية مختلفة لفقدان الطفرات الوظيفية عند العدوى داخل الصفاق وداخل الأنف من تلك التي لوحظت للأنماط المصلية الأخرى. باختصار ، تثبت هذه الدراسة أن السلالة 519/43 (النمط المصلي 1) يمكن تعديلها وراثيا.
Introduction
العقدية الرئوية (S. pneumoniae ، المكورات الرئوية) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات على مستوى العالم. حتى وقت قريب ، تم اكتشاف ما يقرب من 100 نمط مصلي من S. pneumoniae 1،2،3،4،5،6،7. سنويا ، يودي مرض المكورات الرئوية الغازية (IPD) بحوالي 700000 حالة وفاة ، من الأطفال الذين تقل أعمارهم عن 5 سنوات8. العقدية الرئوية هي السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي الجرثومي والتهاب الأذن الوسطى والتهاب السحايا وتسمم الدم في جميع أنحاء العالم9.
في حزام التهاب السحايا الأفريقي ، يكون النمط المصلي 1 مسؤولا عن تفشي التهاب السحايا ، حيث يكون نوع التسلسل (ST) ST217 ، وهو نوع تسلسل شديد الضراوة ، هو السائد 10،11،12،13،14،15. وقد تم تشبيه أهميته في علم أمراض التهاب السحايا بأهميته النيسرية السحائية في حزام التهاب السحايا الأفريقي16. غالبا ما يكون النمط المصلي 1 هو السبب الرئيسي ل IPD. ومع ذلك ، نادرا ما توجد في النقل. في الواقع ، في غامبيا ، هذا النمط المصلي مسؤول عن 20 ٪ من جميع الأمراض الغازية ، ولكن تم العثور عليه فقط في 0.5 ٪ من الناقلين الأصحاء14،17،18،19. يحدث التبادل الجيني وإعادة التركيب في المكورات الرئوية المختصة بشكل عام في النقل وليس في المرضالغازي 20. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن النمط المصلي 1 يحتوي على واحد من أقصر معدلات النقل الموصوفة بين المكورات الرئوية (9 أيام فقط). لذلك ، تم اقتراح أن هذا النمط المصلي قد يكون له معدل إعادة تركيب أقل بكثير من الآخرين21.
من الضروري إجراء دراسات متعمقة لفهم السبب وراء انخفاض معدل نقل سلالات النمط المصلي 1 وأهميته في الأمراض الغازية في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.
نبلغ هنا عن بروتوكول يسمح بالطفرات على مستوى الجينوم لسلالة معينة من النمط المصلي 1 ، 519/43. يمكن لهذه السلالة بسهولة الحصول على الحمض النووي الجديد وإعادة تجميعه في جينومها. هذه الطريقة ليست بعد بين الإجهاد ، لكنها فعالة للغاية عند القيام بها في خلفية 519/43 (تم تحور أهداف أخرى ، والمخطوطات قيد الإعداد). ببساطة باستخدام سلالة 519/43 ، واستغلال كفاءتها الطبيعية ، وكذلك استبدال الطريقة التي يتم بها توفير الحمض النووي الخارجي ، تمكنا من تحور جين pneumolysin (رقائق) في هذه السلالة المصلية 1. تمثل هذه الطريقة تحسينا على الطريقة التي قدمها Harvey et al.22 حيث يتم إجراؤها في خطوة واحدة دون الحاجة إلى تمرير الحمض النووي عبر نمط مصلي مختلف. ومع ذلك ، وبسبب التباين بين السلالات ، لم يتم توحيد أي طريقة لجميع السلالات. إن القدرة على تحور جينات معينة ومراقبة آثارها ستسمح بفهم عميق لسلالات النمط المصلي 1 S. الرئوية وستوفر إجابات لدور هذه السلالات في التهاب السحايا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تزال العقدية الرئوية ، ولا سيما النمط المصلي 1 ، تشكل تهديدا عالميا يسبب مرض المكورات الرئوية الغازية والتهاب السحايا. على الرغم من إدخال لقاحات مختلفة يجب أن تكون وقائية ضد النمط المصلي 1 ، في إفريقيا ، لا يزال هذا النمط المصلي قادرا على التسبب في تفشي الأمراض التي تؤدي إلى ارتفاع م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الصندوق الاستئماني لالتهاب السحايا و MRC على توفير التمويل لهذا العمل.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. . Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
