Summary

Включение компенсации в режиме реального времени в быстрых фотохимических окислениях белков для определения изменений топографии белка

Published: September 01, 2020
doi:

Summary

Быстрое фотохимическое окисление белков является новым методом структурной характеристики белков. Различные растворители добавок и лигандов имеют разнообразные гидроксиловые радикальные свойства очистки. Для сравнения структуры белка в различных условиях для нормализации реакции требуется компенсация в режиме реального времени гидроксиловых радикалов, генерируемых в реакции.

Abstract

Быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) является методом структурной биологии на основе масс-спектрометрии, который зондирует доступную к растворителям поверхностную область белков. Этот метод опирается на реакцию аминокислотных боковых цепей с гидроксильными радикалами, свободно рассеивающихся в растворе. FPOP генерирует эти радикалы на месте с помощью лазерного фотолиза перекиси водорода, создавая взрыв гидроксиловых радикалов, который истощается в порядке микросекунды. Когда эти гидроксиловы радикалы реагируют с растворителем доступной аминокислотной боковой цепи, реакционные продукты демонстрируют массовый сдвиг, который может быть измерен и количественно масс-спектрометрии. Поскольку скорость реакции аминокислоты частично зависит от средней доступной поверхности растворителя этой аминокислоты, измеренные изменения в количестве окисления данной области белка могут быть непосредственно связаны с изменениями в доступности растворителя этого региона между различными конформациями (например, лиганд-связанных по сравнению с лиганд-бесплатно, мономер против агрегата и т.д.) FPOP был применен в ряде проблем в биологии, в том числе белково-белковых взаимодействий, белковых конформациальных изменений, а также связывания белка-лиганда. Поскольку доступная концентрация гидроксиловых радикалов варьируется в зависимости от многих экспериментальных условий в эксперименте FPOP, важно контролировать эффективную радикальную дозу, которой подвергается белковый аналит. Этот мониторинг эффективно достигается путем включения inline дозиметра для измерения сигнала от реакции FPOP, с лазерным гриппом регулируется в режиме реального времени для достижения желаемого количества окисления. С помощью этой компенсации изменения в топографии белка, отражающие конформацию изменений, лиганд-связывающих поверхностей, и / или белково-белкового взаимодействия интерфейсы могут быть определены в неоднородных образцов с использованием относительно низкого количества выборки.

Introduction

Быстрая фотохимическая окисление белков (FPOP) является новым методом определения топографических изменений белка сверхбыстрой ковалентной модификацией поверхности растворителя, за которой следует обнаружение LC-MS1. FPOP генерирует высокую концентрацию гидроксиловых радикалов на месте с помощью ультрафиолетового лазерного флэш-фотолиза перекиси водорода. Эти гидроксиловые радикалы очень реактивны и недолговечны, потребляются примерно на микросекундной шкале времени в условиях FPOP2. Эти гидроксиловые радикалы рассеиваются через воду и окисляют различные органические компоненты в растворе с кинетической скоростью, как правило, начиная от быстрых(10 6 М -1 с-1) додиффузионнно-контролируемых3. Когда гидроксил радикал сталкивается с белковой поверхностью, радикал окисляет аминокислотные боковые цепи на поверхности белка, что приводит к массовому сдвигу этой аминокислоты (чаще всего чистого добавления одного атома кислорода)4. Скорость реакции окисления у любой аминокислоты зависит от двух факторов: присущей реакции этой аминокислоты (которая зависит от боковой цепи и контекстапоследовательности) 4, 5идоступности этой боковой цепи к диффузиву гидроксильного радикала, который тесно коррелирует со средней доступнойплощадью поверхности растворителя 6,,7. Все стандартные аминокислоты, за исключением глицина, были отмечены как помеченные этими высокореактивными гидроксиловыми радикалами в экспериментах FPOP, хотя и с широко отличающимися урожаями; на практике, Ser, Thr, Asn и Ala редко рассматриваются как окисленые в большинстве образцов, за исключением высоких радикальных доз и выявленных тщательной и чувствительной целевой фрагментации ETD8,9. После окисления, образцы утоляются для удаления перекиси водорода и вторичных окислителей (супероксид, синглетный кислород, пептидил гидропероксиды и т.д.) Утоленые образцы затем протеолитически усваиваются для генерации смесей окисленых пептидов, где структурная информация замораживается как химический “снимок” в моделях продуктов окисления различных пептидов(рисунок 1). Хроматография жидкости в сочетании с масс-спектрометрией (LC-MS) используется для измерения количества окисления аминокислот в данном протеолитическом пептиде на основе относительной интенсивности окисленных и неоксидированных версий этого пептида. Сравнивая этот окислительный след одного и того же белка, полученного при различных конформативных условиях (например, лиганд-связанный по сравнению с лиганд-свободным), различия в количестве окисления данной области белка могут быть непосредственно связаны с различиями в растворительной доступной поверхностиобласти этого региона 6,7. Возможность предоставления белковой топографической информации делает FPOP привлекательной технологией для определения структуры высшего порядка белков, в том числе в белковых терапевтическихоткрытиях и разработках 10,,11.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор FPOP. Поверхность белка ковалентно модифицирована высокореактивными гидроксильными радикалами. Гидроксиловы радикалы будут реагировать с аминокислотными боковыми цепями белка со скоростью, которая сильно зависит от растворителя доступности боковой цепи. Топографические изменения (например, из-за связывания лиганда, как показано выше) защитят аминокислоты в области взаимодействия от реакции с гидроксильными радикалами, что приведет к снижению интенсивности модифицированного пептида в сигнале LC-MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Различные компоненты, присутствующие в растворе FPOP (например, лиганды, эксципиенты, буферы) имеют различную активность очистки по отношению к гидроксильным радикалам, генерируемым лазерным фотолизом перекисиводорода 3. Аналогичным образом, небольшое изменение концентрации перекиси, лазерной беглости и буферного состава может изменить эффективную радикальную дозу, что делает воспроизведение данных FPOP сложным в образцах и между различными лабораториями. Поэтому важно иметь возможность сравнить дозу гидроксилового радикала, доступную для реакции с белком в каждом образце с использованием одного из нескольких доступныхгидроксилов радикальных дозиметров 12,,13,,14,,15,,16. Гидроксил радикальные дозиметры действуют, конкурируя с аналитом (и со всеми падальщиками в растворе) за пул гидроксиловых радикалов; эффективная доза гидроксиловых радикалов измеряется путем измерения количества окисления дозиметра. Отметим, что “эффективная гидроксиловая радикальная доза” является функцией как начальной концентрации генерируемого гидроксилового радикала, так и полуиллиона радикала. Эти два параметра частично зависят друг от друга, что делает теоретическое кинетическое моделирование несколько сложным(рисунок 2). Два образца могут иметь дико разные первоначальные радикальные периоды полуиму жизни, сохраняя при этом ту же эффективную радикальную дозу, изменяя начальную концентрацию гидроксилового радикала; они будут по-прежнему генерировать идентичныеследы 17. Аденин13 и Tris12 являются удобными гидроксильно-радикальными дозиметрами, потому что их уровень окисления может быть измерен с помощью УФ-спектроскопии в режиме реального времени, что позволяет исследователям быстро определить, когда есть проблема с эффективной гидроксиловой радикальной дозой и решить их проблему. Для решения этой проблемы важен стационарный дозиметр, расположенный в системе потока непосредственно после места облучения, который может контролировать сигнал от изменения абсорбции аденина в режиме реального времени. Это помогает в проведении экспериментов FPOP в буферах или любой другой excipient с широко различными уровнями гидроксиловой радикальной очистки потенциала17. Эта радикальная компенсация дозировки может быть выполнена в режиме реального времени, что дает статистически неразличимые результаты для того же конформера путем корректировки эффективной радикальной дозы.

В этом протоколе, у нас есть подробные процедуры для выполнения типичного эксперимента FPOP с радикальной компенсации дозировки с использованием аденина в качестве внутреннего оптического радикала дозиметра. Этот метод позволяет следователям сравнивать следы в условиях FPOP, которые имеют различную емкость очистки, выполняя компенсацию в режиме реального времени.

Figure 2
Рисунок 2: Кинетическое моделирование компенсации на основе дозиметрии. 1 мМ аденин дозиметр ответ измеряется в 5 мкм лизозима аналит с 1 мм начальной концентрации гидроксилового радикала (▪OH t1/2 и53нс), и установить в качестве целевого дозиметра ответ (черный). При добавлении 1 мМ от мусорщика экстракции гистидина, дозиметр ответ (синий) уменьшается вместе с количеством окисления белка в пропорциональном порядке (голубой). Сокращается также срок полусысли гиоксилового радикала (▪OH t1/2и39 ns). Когда количество гидроксилового радикала увеличивается, чтобы дать эквивалентный выход окисленного дозиметра в образце с 1 мМ гистидина мусорщика, как достигнуто с 1 мМ гидроксил радикал в отсутствие мусорщика (красный), количество окисления белка, что происходит аналогичным становится идентичным (пурента), в то время как гидроксил радикальных период полуиссяка уменьшается еще больше (▪OH t1/2).= Адаптировано с разрешения Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Protocol

1. Подготовка оптической скамьи и капилляра для FPOP ВНИМАНИЕ: KrF excimer лазеры являются крайними опасностями для глаз, и прямой или отраженный свет может привести к необратимому повреждению глаз. Всегда носите соответствующую защиту глаз, избегайте присутствия любых отражающ…

Representative Results

Сравнение тяжелой цепи пептидного следа адалимумаба биоаналога в фосфатном буфере и при нагревании при 55 градусов по Цельсию на 1 ч показывают интересные результаты. Студенческий т-тест используется для идентификации пептидов, которые существенно изменились в этих двух условиях (p ≤ 0….

Discussion

Массовые спектрометрические структурные методы, в том числе водород-дейтерийный обмен, химическая перекрестная связь, ковалентная маркировка, а также родная масс-спектрометрия и ионная мобильность быстро растут в популярности из-за их гибкости, чувствительности и способности обраба?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем финансирование исследований от Национального института общих медицинских наук грант R43GM125420-01 для поддержки коммерческой разработки скамейки FPOP устройства и R01GM127267 для разработки стандартизации и дозиметрии протоколов для высокой энергии FPOP.

Materials

Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

References

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochemistry. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochemistry. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Play Video

Cite This Article
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

View Video