成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

このプロトコルに記載されている手順は、サンパウロ大学生物医学研究所の動物使用倫理委員会によってゼブラフィッシュモデルで使用することが以前に承認されました。 1. シスプラチン内腹腔内注射によるAKI誘導 ストック溶液を0.9%NaClで850 μg/mLに希釈して 、シスプラチン加工溶液 を調製します。光から保護された室温で保ちます。注意:製造者は、ゴーグル、手袋、ラボコートを含む個人的な保護具(PPE)でシスプラチンの操作をお勧めします。ストック溶液を光から保護した室温で保管してください。 システム水45に150 mg /L MS-222(トリケーヌ)麻酔薬を準備します。約1〜2分間浸漬することにより、成体ゼブラフィッシュ(5~9ヶ月)を麻酔します。注:効果的に麻酔魚はタッチに応答しない必要があります。効果的な麻酔をテストするには、コーダルフィンを軽く押して反応を観察します。注意:トリケーヌは皮膚や目に刺激を与え、PPEを使用して操作します。 プラスチック製のスプーンを使用して、魚をペーパータオルなどの吸収性の表面に移し、体の周りの余分な水を取り除きます。その後、プラスチックスプーンでスケール上のペトリ皿に魚を転送し、魚の重量を量ります。それは線量の計算のために必要になりますので、魚の重量に注意してください。注:魚から余分な水を吸収すると、動物の体重を過大評価を防ぎ、魚に偏見があるので過度に乾燥しないでください。 最終的な重量の120 μg/gの線量を達成するために、最終用量(120 μg)のμgをシスプラチン作動溶液(850 μg)のμg(850 μg)に割り、1000を掛けてマイクロリットル(μL)に変換し、120μgのシスプラチン(141.2μL)の体積を得た。次に、この数値(141.2 μL)を魚の重量(g)に掛けて、最終的な体積を注入します。 プラスチック製のスプーンで、腹側を上にして、それを保持するために少しカットして濡れたスポンジに魚を転送します。スポンジは、システム水の麻酔薬で濡れている必要があります。 31 G 1.0 mL インスリン注射器に、計算されたシス プラチン作業溶液の量を充填します。 骨盤ひれの近くの動物の腹腔内部分に、内臓を穿刺しないように浅い角度で針を挿入する(図2A)。その後、ゆっくりと溶液を注入します。 注射後、魚を水槽に入れて麻酔から回復します。正常な回復の兆候(例えば、 水泳の動き、腹膜運動)のために魚を見てください。注:動物は次の3-5分で回復する必要があります。必要に応じて、プラスチックのスプーン、パスツールプラスチックピペットで移動するか、気泡でホースの近くに置くことによって、魚を刺激します。 対照魚の場合は、0.9%NaClの溶液を注入して同じ手順を実行します。体重の割合に従って同じ計算を使用する:注入される容積は141 μL魚の重量(g)を掛けたものになる。 次の日に少なくとも1日2回魚の生存を監視する(図2B)。 2. 免疫細胞のフローサイトメトリーのための腎臓の分離と組織処理 この手順では、免疫細胞蛍光標識トランスジェニック動物(例えば、Tg(mpo:GFP)を使用してください。 120 μg/g シスプラチンの24 hpiの後、動物を低熱ショック(急速冷え)によって安楽死させる。注:低熱ショックはMS-222過剰摂取よりも安楽死法としてより効果的であることが実証されています。低熱ショックは、MS-222の使用よりも、ストレスが少なく、速く、一貫性があり、人員にとって安全である、46、47を以前に説明した。 外側の交差タンクでは、氷とシステムの水の5:1比で氷水を準備し、氷の上にスクリーンを持つ内側のタンクを入れて、水が2〜4°Cに達するまで待ちます。注:魚は熱熱や痛みを引き起こす可能性があるため、氷と直接接触してはいけません。 動物を氷水に移し、配向が失われ、眼の動きがなくなるまで少なくとも10分待ちます。 プラスチック製のスプーンで、余分な水を乾燥させるためにペーパータオルの上に魚を置きます。 魚を3%アガロース解剖プレートに移し、上光を持つステレオスコープの下に持って行きます。はさみで、目のすぐ後ろで速い切り傷を作る魚の首を切り落とし、頭を取り除きます。 細かいはさみで開いた側からクロアカに切り取り、細かい鉗子で内臓を取り除きます。 昆虫ピンを使用して、ボディウォールの側面をつまんで死体を開き、バックボーンに取り付けられた腎臓を露出させます。 腎臓を細かい鉗子で取り外し、1x PBS/2Sの冷たい溶液で6ウェルプレートに臓器を入れる。氷の上に置いておきなさい。 パスツールプラスチックピペットで組織をピックアップし、50 mLチューブ上の40 μmの細胞ストレーナーを通して組織を通過させ、注射器プランジャーでそっと浸漬します。 1x PBS/2Sの1 mLで2回洗浄し、50 mLチューブに細胞を集めます。 遠心分離細胞は400×gで5分間4°Cで5分間。 慎重に1 mLのマイクロピペットですべての上清を拾い、それを捨てます。500 μLのコールド1x PBSを加えて細胞を再懸濁し、5 mLフローサイトメトリーチューブに入れます。氷の上に置いておきなさい。 トリパンブルーで1:10希釈を行うノイバウアーチャンバーのセル数を数えます(例えば、サンプルの10 μLを取り、トリパンブルーの90 μLと混合します)。混合物の10 μLをノイバウアーチャンバーに加え、顕微鏡下で細胞を数えます。注: 最適な結果は、1-5 x 106 個のセル/mL と >80% の生存率で期待されます。注意:トリパンブルーは発がん性薬剤であり、PPEを使用して処理します。 細胞計で読み取る細胞を取る。次に、対象となる母集団を選択した結果を分析します。 3. TUNELアッセイ用の成体ゼブラフィッシュ腎臓組織の処理 この手順では、同様の蛍光がTUNELの分析を妨げる可能性があるとして、野生型動物(例えば、AB、テュービンゲンなど)またはTUNELキットとは異なる蛍光色のトランスジェニック動物を使用してください。 120 μg/g シスプラチンの24 hpiの後、動物を低熱ショック(急速冷え)によって安楽死させる。2.3-2.4を参照してください。 2.5-2.6 に記載されているように魚を解剖;腎臓は固定手順の間にバックボーンに付着したままにする必要があります(以下の説明)。 昆虫のピンを使用して、体の壁の側面をつまんで死体を開き、コルクの表面に固定して腎臓を露出させます。注:この手順は、腎臓が後で分析するために適切な位置に残っていることを保証します。 その後、腎臓を下に向けたコルク表面を6ウェルプレートに置き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の新しく作られた溶液の上に置きます。4°Cで一晩保管してください。注意:PFAは皮膚および粘液表面に発がん性があり、刺激性である。目の保護装置を含むPPEを使用して化学フードの下でPFAソリューションを準備します。 翌日、腎臓を2.8のように解剖する。1x PBSで60mmのペトリ皿に腎臓を入れ、1x PBSで2回洗いすります。 2%アガロースを準備し、組織の支持マトリックスを生成する。 ペトリ皿から残りのすべての1x PBSを捨て、臓器全体を覆うためにゆっくりと2%アガロースを注ぎます。次に、腎臓を折り畳むのを防ぐために、体型顕微鏡下で微細な鉗子を使用して腎臓を配置します。アガロースを室温で固めます。注:この手順は、器官の葉のような形が支持マトリックスの中になければ折り畳む傾向を引き起こすので、組織学的処理を通じて器官の向きと形状を維持します。 アガロース固化後、メスを使って組織の周りにアガロースを切断し、小さな立方体を形成し、組織の周りにアガロースの過剰を除去する。 アガロースキューブを組織学的処理に適したカセットに入れます。メモ:次の手順は、手動または自動ティッシュプロセッサで行うことができます。 まず、カセット内の組織を室温で45分間処理し、それぞれ45分間、50%エタノールの浴1浴、70%エタノールの浴1浴、95%エタノールの2つの連続浴、および100%エタノールの3つの連続した浴を処理する。その後、キシレンの2つの連続した浴とパラフィンの3つの連続した浴で組織を処理します。後者は60°Cでそれぞれ1時間続きます。注意:化学フードの下で変更を加え、エタノールとキシレンからの蒸気は刺激性と有毒です。 パラフィンブロックを調製するために、パラフィンレンズ豆を60°Cに溶融する。 プラスチックカセットを内部のティッシュで開け、暖かい皿の上に置いてください。パラフィン用のウォームアップメタル金型。 ピンセットを使用すると、腎臓の長さが金型ベースに平行になるように、金属モールドの上に組織を配置します。パラフィンを加え、必要に応じて組織を再割り当てします。 カセットのベースで金型を覆い、グリッドが覆われるまでパラフィンを追加します。室温で固め、次に-20°Cで置き、より速い凝固プロセスを行います。 20~30分後に、金属モールドからパラフィンブロックを放出します。 ミクロトームを用いて、パラフィンに埋め込まれた組織を5μmの厚さに切り離す。組織を収集するために、シラナイズまたは正に帯電したガラススライドを使用してください。 4. チューンルアッセイ 注: 次のプロトコルは、In Situ 細胞死検出キット (材料表) を使用します。 脱ワックス組織は、5分間キシレンの2つの連続した浴場に置くスライド。次に、エタノールの等級シリーズを通して組織を水分補給する:100%-95%-70%-50%、それぞれ5分間。 冷たい水道水を流してエタノールをすすいでください。スライドを蒸留水に入れます。 暗いインキュベーターチャンバーを準備します。インキュベーションの段階で水分を保つために底部に濡れたペーパータオルを追加します。注:インキュベーターチャンバーの欠如では、底部に湿った紙とスライドを配置するために2つのつまようじでペトリ皿を使用することが可能です。 新鮮な プロテイナーゼKの作業ソリューションを準備する:10 mMトリス/HCl、pH 7.4-8で10 μg/mL。注:プロテイナーゼKは、製造者が推奨するパーメアビライゼーション剤として使用されます。 暗いインキュベーターチャンバーにスライドを置き、サンプルをカバーするまで プロテアーゼK作業溶液 を追加します。37°Cで30分間インキュベートします。 サンプルがインキュベートされている間 、TUNEL反応混合物を調製する: 酵素溶液50 μLを450 μLラベル溶液に加えます。光から守る。メモ:準備するボリュームは、同じ1:10の割合で調整することができます。体積は各セクションの混合物の50 μLであると計算されます。これはサンプルのサイズによって変わる可能性があります。 暗い部屋を拾い、1x PBSでスライドを2回洗います。 次に、吸収性紙を用いて試料の周りの領域を乾燥し、各組織スライド上に50μLの TUNEL反応混合物 を加え、サンプル全体が覆われるように溶液を広げる。37°Cで2時間インキュベートする。光から守る。 インキュベーション後、スライドを1x PBSで3回すすいで、ペーパータオルを使ってサンプルの周りの領域を乾燥させます。 サンプルに50 μLのDAPI 1:1000を加え、核カウンター染色を行い、室温で5分間インキュベートします。光から守る。 1x PBSで再び3回リンスし、サンプルの周りの領域を乾燥させます。 スライドを抗フェード親水媒体で取り付け、カバースリップを置き、マニキュアで密封します。スライドを水平に保管し、4 °Cで光から保護します。注:取り付け培地のアンチフェード特性は、サンプルの蛍光を維持するためにありますが、利用可能な任意の親水性媒体を使用することが可能です。マニキュアによる最終シーリングステップは、脱水を避けるために重要です。 蛍光顕微鏡でサンプルを可視化します。このタイプの蛍光顔料の場合、520~560nm(緑色)の範囲で励起波長を使用し、570-620nm(赤色)の範囲で検出します。