JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
español

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Un modelo de bucle hemodinámico In Vitro para investigar la hemocitocompatibilidad y la activación de células host de dispositivos médicos vasculares

Published: August 21, 2020
doi:
10.3791/61570
, , , , , , , , ,
1Department of Cardiothoracic Surgery,Otto-von-Guericke-University, 2Department of Mechanical Engineering, Institute for Materials and Joining Technology,Otto-von-Guericke-University, 3Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry,Otto-von-Guericke-University, 4Division of Cardiology and Angiology, Department of Internal Medicine,Otto-von-Guericke-University

Summary

Aquí se presenta un protocolo para un modelo de bucle hemodinámico estandarizado. Este modelo permite probar la hemocompatibilidad de tubos de perfusión o stents vasculares para estar de acuerdo con la norma ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.

Abstract

En este estudio, la hemocompatibilidad de tubos con un diámetro interno de 5 mm de cloruro de polivinilo (PVC) y recubiertos con diferentes conjugados bioactivos se comparó con tubos de PVC no recubiertos, tubos de látex y un stent para la aplicación intravascular que se colocó dentro de los tubos de PVC. La evaluación de la hemocompatibilidad se realizó utilizando un modelo de bucle hemodinámico in vitro recomendado por la norma ISO 10993-4. Los tubos se cortaron en segmentos de idéntica longitud y se cerraron para formar bucles evitando cualquier hueco en el empalme, luego se llenaron con sangre humana y se giraron en un baño de agua a 37 oC durante 3 horas. A partir de entonces, se recogió la sangre dentro de los tubos para el análisis del recuento de células sanguíneas enteras, la hemólisis (hemoglobina plasmática libre), el sistema de complemento (sC5b-9), el sistema de coagulación (fibrinopéptido A) y la activación de leucocitos (laastasa polimorfonuclear, factor de necrosis tumoral e interleucina-6). Se determinó la activación de la célula huésped para la activación plaquetaria, el estado de la integrina de leucocitos y los agregados plaquetario monocitocitos utilizando citometría de flujo. El efecto del cierre inexacto del bucle se examinó con microtomografía de rayos X y microscopía electrónica de barrido, que mostraba la formación de trombos en el empalme. Los tubos de látex mostraron la activación más fuerte de los componentes plasmáticos y celulares de la sangre, lo que indica una hemocompatibilidad deficiente, seguido por el grupo de stent y los tubos de PVC sin recubrimiento. Los tubos de PVC recubiertos no mostraron una disminución significativa en el estado de activación plaquetaria, pero mostraron un aumento en el complemento y la cascada de coagulación en comparación con los tubos de PVC sin recubrimiento. El modelo de bucle en sí no condujo a la activación de células o factores solubles, y el nivel de hemólisis era bajo. Por lo tanto, el modelo de bucle hemodinámico in vitro presentado evita la activación excesiva de los componentes sanguíneos por fuerzas mecánicas y sirve como método para investigar las interacciones in vitro entre la sangre del donante y los dispositivos médicos vasculares.

Introduction

Las pruebas de hemocompatibilidad de dispositivos médicos son un paso crucial en el desarrollo de nuevos dispositivos como stents vasculares o tubos de perfusión para la oxigenación de membrana extracorpórea. Hasta hoy, los modelos animales se consideran como herramientas estándar para finalizar el procedimiento de prueba de los dispositivos médicos antes de su implementación en humanos. A partir de ahora, es necesario encontrar modelos in vitro alternativos que ayuden a minimizar las investigaciones en animales. En este estudio, por lo tanto, hemos explorado un modelo de bucle hemodinámico in vitro en miniatura. El objetivo de este método presentado es probar la compatibilidad in vitro de la sangre de los dispositivos médicos de acuerdo con la norma ISO 10993-4.

La norma ISO 10993-4 describe conjuntos estandarizados de parámetros clínicos a investigar en la muestra de sangre1. Brevemente, se trata de trombosis (agregación y recuento de plaquetas), coagulación (fibrinopéptido A, FPA), análisis hematológico (recuento completo de células sanguíneas), índice de hemólisis (hemoglobina plasmática libre) y el sistema de complemento (complejo de complemento terminal, sC5b9). Sin embargo, también se pueden tener en cuenta marcadores adicionales, como la elastasa polimorfonuclea polimorfonuclea (PMN), la interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral – alfa (TNF) que refleja el estado de activación de los leucocitos para las mediciones. Para determinar y cuantificar las proteínas libres de células circulantes que están presentes en el plasma sanguíneo, el ensayo inmunoabsorbente ligado enzimático sándwich (ELISA) representa un método convencional y más fiable2,3. Del mismo modo, el fenotipo y el estado de activación de las células huésped (por ejemplo, leucocitos) se pueden cuantificar detectando la expresión de la superficie celular de las moléculas por citometría de flujo (FACS) que proporciona lecturas basadas en suspensión de una sola célula, donde los anticuerpos específicos con etiqueta fluorescente se unen a las moléculas de superficie celulardirigidas 4. La microscopía electrónica de barrido (SEM) también se recomienda para determinar la formación de trombos en el material probado por la norma ISO 10993-41. Este método se puede complementar con la microtomografía de rayos X (CCT), para realizar análisis estructurales del trombo, por ejemplo, su grosor, tamaño y localización en una imagen renderizada en 3D5.

La razón de ser detrás de usar este modelo hemodinámico in vitro es detectar los mejores dispositivos médicos compatibles y de mejor rendimiento mediante la comprensión de la dinámica fisiológica básica de los componentes sanguíneos como las plaquetas, que participan en la hemostasia primaria o leucocitos y su interacción con diferentes tipos de dispositivos vasculares. Estos sistemas in vitro son muy demandados, ya que reducen la necesidad de estudios en animales.

El modelo de bucle aquí presentado satisface estas demandas. Este modelo fue descrito por primera vez por A.B. Chandler en 1958 para la producción de trombos de sangre y, por lo tanto, también se llama Chandler Loop modelo6. Hasta ahora, este modelo se ha utilizado en una serie de experimentos y modificaciones para investigar la biocompatibilidad sanguínea de dispositivos médicos7,8,9,10,11,12,13,14. Consiste en tubos de polímero, que se llenan en parte de sangre y se forman en bucles re-closables. Estos bucles giran en un baño de agua con temperatura controlada para simular condiciones de flujo vascular con sus efectos hemoreológicos. Ya se han descrito métodos alternativos como modelos accionados por bomba o modelos que utilizan válvulas de bola mecánicas dentro de los bucles para inducir un flujo sanguíneo dentro de los tubos de polímero15,16. Sin embargo, la ventaja general del método aquí presentado es que la fuerza mecánica aplicada a las células sanguíneas y proteínas es baja, evitando la hemólisis, y no hay contacto entre la sangre y los conectores, que posiblemente podría conducir a turbulencias de flujo y activación de los componentes sanguíneos. Los principales factores de activación dentro del bucle son el propio material de prueba y el aire que está atrapado en su interior. Esto ayuda a minimizar las fuentes de error de medición y a proporcionar una alta reproducibilidad, incluso si la interfaz sangre-aire puede conducir a la desnaturalización deproteínas 17. También es posible investigar variedades de materiales de tubo y diámetros de stent sin restricciones de longitud o tamaño permitiendo así el uso de tubos de diferente longitud y diámetro interior. Además, también es posible investigar las hemocompatibilidades del huésped sobre el cierre inexacto del lazo y la exposición a la superficie del tubo sin recubrimiento. Otras aplicaciones médicas similares de este modelo de bucle hemodinámico in vitro es que también podría utilizarse para estudiar las interacciones entre la inmunoterapia (drogas) y los componentes sanguíneos durante el desarrollo preclínico o el cribado individual de la seguridad de los medicamentos antes del ensayo clínico de primera fase I, o para la generación de material trombo que se puede utilizar en experimentos posteriores18,19,20.

Este estudio describe un protocolo detallado para probar las hemocompatibilidades de tubos de perfusión y/o stents. Aquí, la comparación entre tubos de PVC sin recubrimiento y recubiertos (hepPVC: recubrimiento de heparina, poliPVC: recubrimiento con polímero bioactivo). Se redujo la activación de las plaquetas, pero se encontró una mayor activación del sistema de coagulación (FPA) para ambos tubos recubiertos en comparación con los tubos no recubiertos. Los tubos hepPVC utilizados aquí se modifican con heparina unida covalentemente para hacerlos resistentes a la tromborrea21 y ya han sido empleados en un modelo de bucle para optimizar y caracterizar diferentes parámetros22. Los tubos poliPVC utilizados en este estudio son tubos disponibles comercialmente utilizados en entornos clínicos de perfusión extracorpórea de sangre y están recubiertos con un polímero de heparina para reducir su trombogenidad23. A veces, en aplicaciones clínicas incluso se utilizan tubos de PVC sin recubrimiento. Por lo tanto, incluimos tubos de látex como un grupo de control positivo que mostró una activación excesiva de plaquetas, sistema de coagulación y factores solubles como IL-6, TNF y PMN elastasa. La formación de trombos se notó cuando se simulaba un cierre de bucle inexacto. Esto condujo a la activación del sistema de coagulación y complemento, así como leucocitos y plaquetas en comparación con las condiciones basales. Además, el contacto con la sangre con el material de stent aquí utilizado (stent de nitinol de metal puro, cubierto con politetrafluoroetileno expandido impregnado de carbono) condujo a una mayor activación de plaquetas y leucocitos en términos de la elastasa PMN. En general, el modelo presentado no indujo hemólisis en ninguno de los dispositivos vasculares probados, ya que eran comparables a las condiciones basales o estáticas, excepto en los tubos de látex, donde la hemólisis de glóbulos rojos (RBC) era obvia. Además, estos tubos de perfusión se pueden examinar por imágenes o por histología. Aunque las evaluaciones histológicas podrían ser factibles, nos centramos principalmente en ELISA y citometría de flujo para realizar estos experimentos y así permitir la viabilidad de realizar experimentos basados en el modelo aquí presentado para muchos laboratorios. Por lo tanto, este método representa un método factible para probar la biocompatibilidad en sangre de los dispositivos médicos vasculares de acuerdo con las recomendaciones de la norma ISO 10993-4. Además, este método se puede utilizar siempre que se pruebe una interacción entre la sangre y los materiales en condiciones de flujo, imitando las condiciones in vivo.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la facultad de medicina del Hospital Universitario de Magdeburgo (número de solicitud 88/18) y los sujetos proporcionaron consentimiento informado por escrito antes del procedimiento de dibujo de sangre. 1. Preparación de heparina y muestreo de sangre Calcular la cantidad de sangre necesaria para todos los experimentos.NOTA: Casi, se requieren 5 ml de sangre heparinizada para cada dispositivo vascular en duplicados (bucles). Del mismo modo, se requieren 5 ml de sangre para cada condición basal y estática que se mantiene a un lado a temperatura ambiente. Preparar una solución de heparina a una concentración de 100 UI/ml diluyendo la heparina no fraccionada (por ejemplo, Rotexmedia) en agua desionizada. Utilice 150 l de esta solución para la heparinización de sangre fresca de 10 ml. Calcular la cantidad de sangre, así como el plasma que se necesita para el recuento completo de células sanguíneas, ensayos ELISA y FACS.NOTA: Las mediciones representadas en este estudio se obtienen de dos bucles que se ejecutan en paralelo (uno como duplicado) con un volumen sanguíneo total de 10 ml. En función de la cantidad necesaria de sangre, llene 10 ml de jeringas con 150 ml de solución de heparina para prevenir la coagulación de la sangre con una concentración final de heparina de 1,5 UI/ml de sangre. Extrae sangre usando una mariposa (tamaño: 21 G). Llene las jeringas con mucha succión para evitar la hemólisis o la activación celular debido al vacío excesivo.NOTA: El permiso del comité ético local debe obtenerse antes del inicio de los experimentos. Obtener el consentimiento informado de cada donante de sangre humana. Asegúrese de que el donante de sangre esté sano y no tome ningún medicamento, especialmente ningún agente antiplaquetario o antiinflamatorios no esteroideos durante al menos 10 días antes de los experimentos. Cabe destacar que se prefiere el mismo donante al comparar diferentes tipos de dispositivos vasculares por primera vez como se presenta en este manuscrito. Para evaluar aún más las diferencias inter-individuales, el protocolo se puede repetir con diferentes donantes. Recoger la sangre en un vaso de vaso, evitar la agitación excesiva. 2. Montaje de bucle hemodinámico in vitro Llene el baño de agua hasta que el nivel del agua alcance hasta el centro de la unidad de rotación. Ajuste la temperatura del agua a 37 oC. Montaje de bucle para probar diferentes materiales de tubería (polyPVC, hepPVC, PVC y látex) Corte dos piezas de 50 cm de largo de cada material de tubo (diámetro interior 5 mm) con el cortador de tubos. Asegúrese de que la superficie de corte es plana, ya que esto es especialmente importante para un cierre perfecto para los bucles con diámetros pequeños para que la sangre fluya sin ninguna distorsión en el borde de ajuste.NOTA: Todo este protocolo utiliza los tubos con un diámetro interior de 5 mm. Para facilitar el manejo y evitar el retardo de procesamiento posterior a la muestra después de la rotación, ejecute solo cuatro bucles (2 materiales en duplicados) en paralelo. Para generar una forma de bucle, conecte las terminaciones abiertas de los tubos en una pieza corta de tubo de silicio que se ajuste al diámetro exterior del tubo de investigación. Utilice las bandas de tensión de policarbonato para asegurar el cierre adecuado de los bucles. Cuando se utiliza por primera vez, ajuste la longitud de las bandas para ajustar el diámetro exterior del lazo cortando la banda de tensión con tijeras en longitudes requeridas y asegúrela con una llave de torsión de 3 mm. Apriete cuidadosamente el tornillo de bloqueo del conector de la banda de tensión bajo la inspección de las terminaciones del tubo. Ajuste la fuerza de cierre para que no quede ningún hueco entre las terminaciones del tubo. Si el tornillo de bloqueo está totalmente apretado y la tensión de la banda de policarbonato parece demasiado baja para cerrar el espacio entre las terminaciones del tubo, abra el sistema de bloqueo y corte unos pocos mm de la banda de tensión. Repita esto, hasta que se logre un cierre preciso del bucle(Figura 1A). Si el material de tubo es muy suave y tiende a deslizarse dentro de las bandas de tensión, fije el lazo con cinta eléctrica a la banda de tensión (Figura 1B,C). Prepare un bucle adicional de PVC para el control de temperatura con las mismas dimensiones que los bucles de prueba. Fije los bucles en la base de bucle de la unidad de rotación fuera del baño de agua. A continuación, conecte la base del lazo a la unidad de rotación dentro del baño de agua(Figura 1E). Desmontar la banda de tensión en parte de los bucles y desenchufar un extremo de cada tubo para abrir el bucle. Llene suavemente cada bucle con 5 ml de sangre con una pipeta serológica de 5 ml. Mezcle la sangre suavemente dos veces en el vaso de vidrio pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo antes de cargarla en los bucles. Tome el termómetro desechable y colóquelo dentro del bucle de control de temperatura. Si el termómetro es demasiado grande, córtelo con tijeras para que se ajuste a tubos más pequeños. Llene el lazo con 5 ml de agua desionizada a temperatura ambiente. Cierre los bucles y asegúrese de que los bucles, las bandas de tensión y el bastidor estén correctamente instalados. Ajuste la velocidad de rotación a 30 rondas por minuto (rpm) y gire durante 3 h. Conjunto de bucles para probar el impacto del cierre de bucle incorrecto (brecha) Prepare cuatro bucles (polyPVC) como se describe en 2.2. Cierre dos de los bucles correctamente con las bandas de tensión y evite cualquier separación entre las terminaciones del tubo. Para los otros dos bucles enchufe las terminaciones abiertas en el tubo más grande como se describe en 2.2.3, pero deje un espacio de 1-2 mm entre las terminaciones de bucle. No utilice las bandas de tensión para estos bucles (Figura 1D). Prepare un bucle de control de temperatura como se describe en 2.2.7 y 2.2.11. Llene todos los bucles con sangre como se describe en 2.2.10. Ajuste la velocidad de rotación a 30 rpm y gire durante 3 h. Conjunto de bucles para pruebas de stent Prepare cuatro bucles como se describe en 2.2 y siguientes.NOTA: Para evaluar la biocompatibilidad sanguínea de los stents, el propio material de tubería debe ser probado para ser biocompatible con el fin de evitar el enmascaramiento de la activación celular. Si no existen datos, el propio material del tubo se puede probar como se describe en 2.2. Además, se puede aplicar el rango de diámetro dentro del stent (consulte las instrucciones del fabricante) y debe ajustarse al diámetro interior del material del tubo. Abra dos de los bucles y saque el tubo del sistema de banda de tensión. Inserte el stent en el centro del tubo según las instrucciones del fabricante. Utilice los otros dos bucles sin stent como control. Llene todos los bucles con sangre como se describe en 2.2.10. Ajuste la velocidad de rotación a 30 rpm y gire durante 3 h. Control de temperatura En cualquier momento durante la duración y cuando se detiene la rotación, la temperatura de la sangre dentro de los bucles se indica mediante el termómetro dentro del bucle de control de temperatura. Para leer la temperatura, detenga la rotación y lea inmediatamente la temperatura indicada por el termómetro. 3. Procesamiento de muestras de sangre Después de la rotación, deje que los bucles se pongan de pie en el bastidor durante 2 minutos en una posición hacia arriba para dejar que la sangre se acumule en la parte inferior de los bucles, evitando cualquier derrame al abrir los bucles. Inspeccionar la sangre que queda en busca de condiciones estáticas: Si esta sangre está coagulada, en última instancia se sospecha una heparinización inadecuada. En este caso, repita el experimento preferiblemente también con otro donante de sangre. Saque con cuidado los bucles del bastidor. Abra los conectores y deje que la sangre fluya en un vaso de vidrio de 10 ml. Alicúe la sangre de los tubos que se ejecutan en duplicados. Extraiga sangre fresca para el análisis basal del mismo donante como se describe en 1.5 y 1.6. Recogida de sangre de citrato de sodio Para la recolección de sangre de citrato de sodio, llene cuatro tubos de 1,5 ml, cada uno con 111 l de solución de citrato sódico recogida a partir de tubos de citrato de sodio, para generar una concentración final de 3,2% de citrato sódico. Llene cada tubo con 1 ml de sangre de los vasos de vidrio como se describe en 1.6 y 3.3. Mantenga la sangre a temperatura ambiente y utilice esta sangre para los análisis de FACS como se describe en 12.NOTA: Para cambiar la longitud de los bucles para diferentes configuraciones experimentales, planifique correctamente las alícuotas en función de la cantidad de mediciones que se deben realizar. Puede ser necesario establecer todas las mediciones necesarias con sangre fresca antes de los experimentos reales para asegurar que el volumen de sangre en los bucles sea suficiente para todas las mediciones. Recogida de muestras de sangre y plasma de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA). De cada vaso de precipitados de vidrio con sangre (ver 1.6 y 3.3) transferir 4,5 ml de sangre a un tubo EDTA de 5 ml. Llene con sangre dos tubos EDTA de cada vaso de vidrio de 10 ml. Mezcle suavemente la sangre y manténgala en hielo. Transfiera 2 ml de sangre a un tubo de centrifugación de bloqueo de 2 ml y utilice esta sangre para el recuento de células sanguíneas y la medición libre de hemoglobina como se describe en 5. Y 6. Centrifugar la sangre restante a 3.500 x g durante 20 min. Recoger cuidadosamente el plasma en el sobrenadante en alícuotas de 500 l y congelar inmediatamente a -80 oC. 4. Microscopía electrónica de barrido e imágenes de LA TCT Después del procesamiento de la muestra de sangre, enjuague los bucles vaciados preparados como se describe en 2.3 con 10 ml de solución salina tamponada por fosfato (PBS) cada una. Corte cuidadosamente una muestra de 1 cm de largo de cada extremo de cada tubo con un bisturí. Incubar la muestra durante la noche a 4oC en una solución de glutaraldehído al 2%.ADVERTENCIA: La inhalación de vapores de aldehído puede causar síntomas nasales como un congestión persistente del ore de la nariz con necio e irritación de las vías respiratorias, y el contacto con la piel causa dermatitis. Los aldehídos deben manipularse con capucha de humos mientras usan guantes, una bata protectora y gafas de seguridad. Enjuague la muestra (3 veces) con PBS. Preparar una solución del 1% de tetróxido de osmio (OsO4)en agua desionizada e incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente.ADVERTENCIA: OsO4 es un agente oxidante fuerte, se puede reducir por la exposición a la luz. Para evitar la reducción durante la preparación, guarde OsO4 en una botella de vidrio marrón. OsO4 es extremadamente volátil, sus humos son tóxicos para los ojos, la nariz y la garganta. Trabaje siempre bajo una campana de humo y use guantes y ropa protectora, asegurando que ninguna parte del cuerpo esté expuesta a OsO4. Póngase en contacto con las directrices de su institución con respecto a la manipulación y el almacenamiento de residuos. En general, OsO4 es almacenable durante varios meses, pero necesita botellas de vidrio especiales con revestimiento de teflón y un desecador, ya que OsO4 puede decolorar las superficies internas y el contenido del refrigerador en presencia de fugas de humos. Saque muestras, transfiéralas en un nuevo tubo centrífugo de 15 ml y enjuague las muestras 3 veces con PBS. Preparar una serie de etanol con diferentes concentraciones (25%, 50%, 75%, 95%, 100%) Deshidratar muestras en etanol: incubar durante 20 min cada una en 25%, 50%, 75% y 90% y 30 min en 100%. Tome muestras de etanol 100% y déjelo secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. Examine las muestras en el microscopio electrónico de barrido a una tensión de aceleración de 5 kV y con el escáner de rayos X. 5. Recuento de células sanguíneas Tomar 2 ml de sangre EDTA obtenida como se describe en 3.7.3 Inserte el tubo en el analizador de hematología automatizado y siga las instrucciones del fabricante. 6. Medición de la hemoglobina libre (fHb) en plasma Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5. Almacenar sobre hielo después de descongelar.NOTA: Descongele siempre las muestras de plasma congelado en un baño de agua a 37 oC y transfiera inmediatamente al hielo, que contenga un poco de agua, para bajar la temperatura. Esto es importante para evitar la activación de los componentes sanguíneos durante la descongelación. Utilice el reactivo fHb y siga las instrucciones del fabricante. Evite la contaminación después de la apertura y proteja el reactivo de la luz directa (sol, luz UV). Utilice un esquema de pipeteo (consulte las instrucciones del fabricante) con dilución 1:5. Añadir 1000 l del reactivo de hemoglobina en una cubeta semimicro de 1,6 ml. Utilice esta cubeta para determinar el valor en blanco. Añadir 1000 l del reactivo de hemoglobina y 250 l de la muestra plasmática en otra cubeta semimicro. Mezclar el contenido en ambas cubetas enjuagando bien la pipeta rellenando repetidamente con mezcla de reacción, e incubar al menos 3 minutos a temperatura ambiente. Determinar la extinción (E) de la muestra contra el reactivo fHb como reactivo en blanco. Calcular la concentración de fHb (mmol/l) de la muestra: E540-E680 x 0.452. 7. Medición de FPA Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5 y almacenar en hielo después de descongelar. Utilice el kit FPA Elisa y siga las instrucciones del fabricante. 8. Medición de sC5b9 Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5 y almacenar en hielo después de descongelar. Utilice el kit ELISA sC5b-9 y siga las instrucciones del fabricante. 9. Medición de PMN Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5 y almacenar en hielo después de descongelar. Utilice el kit ELISA PMN-Elastase y siga las instrucciones del fabricante. 10. Medición del TNF Las microplacas deben estar recubiertas un día antes de ejecutar el ELISA. Para el recubrimiento, agregue 100 l de solución de anticuerpos de captura a todos los pocillos, la placa de sellado y la incubación durante la noche a 2 oC-8 oC. Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5. Almacenar sobre hielo después de descongelar. Utilice el kit TNF ELISA y siga las instrucciones del fabricante. 11. Medición de IL-6 Las microplacas deben estar recubiertas con anticuerpos de captura un día antes del experimento. Para el recubrimiento, agregue 100 l de solución de anticuerpos de captura a todos los pocillos de la microplaca provista con el conjunto, la placa de sellado y la incubación durante la noche a 4 oC Descongelar una muestra plasmática de cada condición obtenida como se describe en 3.7.5. y almacenar en hielo después de descongelar. Utilice el kit ELISA IL-6 y siga las instrucciones del fabricante. 12. Análisis FACS Preparar 500 ml de tampón FACS añadiendo 10 ml de suero de ternera fetal y 2 ml de solución EDTA (0,5 M) a 488 ml de 1x PBS. El tampón FACS se puede almacenar durante 4 semanas a 4oC. Utilice 100 l de la sangre de citrato sódico (ver 3.6.3) para cada procedimiento de tinción (agregados plaquetarios monocitos (MPA), activación plaquetaria (PA), integrinas de leucocitos (LI)). Pipetear 100 l de sangre de cada muestra en un tubo FACS de 5 ml. A partir de cada muestra, prepare 3 tubos para la tinción de anticuerpos y etiquete con panel MPA (agregados plaquetarios monocitos), panel PA (agregados plaquetarias) y panel LI (leucocitos integrina). Mezclar el resto de las 4 muestras en un tubo FACS de 5 ml. Utilice esta mezcla para controles no manchados y de fluorescencia menos uno (FMO). Preparar 6 tubos FACS pipeteando 100 l de la sangre de la muestra mezclada en cada tubo. Etiqueta 3 tubos como sin mancha y 3 tubos como FMO-CD41, FMO-CD62P y FMO-CD162. Añadir 100 l de solución de paraformaldehído al 4% e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.ADVERTENCIA: El paraformaldehído es tóxico para la piel y los ojos. Puede causar irritación pulmonar grave cuando se inhala y puede provocar daño pulmonar después de una exposición prolongada. Además, se clasifica como carcinógeno y toxina reproductiva. Use siempre guantes y gafas de seguridad y trabaje bajo la campana de humos. Añadir 1 ml de tampón de lavado a cada tubo y centrífuga a 287 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado dos veces. Para la lisis de glóbulos rojos (RBC), agregue 1 ml de tampón de 1x tampón de lisis RBC (diluir 10x tampón de lisis RBC en agua desionizada), mezcle pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5 minutos en RT en la oscuridad. Prepare cuentas de compensación para manchas individuales. A 1 mL de búfer FACS agregue 4 gotas de cada perla positiva y negativa. Vortex a fondo y añadir 100 l de solución de perlas a un tubo FACS de 5 ml. Prepare 4 tubos con cuentas y etiquete como CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC y CD62P-PE. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada tubo y centrífuga a 287 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y manténgase en hielo. Después de la lelisis RBC, agregue 1 ml de tampón FACS a cada tubo y lave como se describe en 12.7. Deseche el sobrenadante. Preparar cócteles de anticuerpos: Panel MPA: Agregue 4 l de CD45-APC, 4 l de CD14-FITC y 4 l de CD41-BV421 a 388 l de búfer FACS. Panel PA: Agregue 1,6 l de CD41-BV421 y 12 l de CD62P-PE a 386,4 ml del búfer FACS. Panel LI: Agregue 4 s de CD45-APC y 8 l de CD162-BV421 a 388 l de búfer FACS. Manténgase en hielo. Preparar las manchas individuales: Agregue 0,5 l a 499,5 ml de búfer FACS cada una para CD14-FITC, CD41-BV421 y CD45-APC. Para cd62P-PE, agregue 0,3 l a 499,7 l del búfer FACS. Manténgase en hielo. Preparar los controles FMO: (i) Panel MPA (FMO-CD41): Añadir anticuerpo CD14-FITC de 1 l y 1 l de anticuerpo CD45-APC a un tampón FACS de 98 l. (ii) Panel PA (FMO-CD62P): Agregue 0,4 l de CD41-BV421 a 99,6 l del búfer FACS. (iii) Panel LI (FMO-CD162): Añadir 1 l de CD45-APC a 99 l de búfer FACS. Mantenga los controles FMO sobre hielo. Cócteles de anticuerpos Vortex y añadir 100 l de cada cóctel de anticuerpos tal y como se prepara en 12.12 a cada uno de los respectivos tubos etiquetados (panel MPA, PA y LI) como se describe en 12.3 y mezclar suavemente entubando hacia arriba y hacia abajo. Manténgase en RT en la oscuridad. Diluciones de anticuerpos antimanchas únicas de vórtice y añadir 100 l de las diluciones de anticuerpos de tinción únicas preparadas en 12.13. a cada uno de los respectivos tubos etiquetados con perlas como se describe en 12.7 y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Manténgase en RT en la oscuridad. Cócteles de anticuerpos Vortex FMO y añadir 100 l de cada cóctel de anticuerpos FMO-1 preparado en 12.14. a cada uno de los tubos etiquetados respectivos (controles FMO) como se describe en 12.5. y mezclar suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Manténgase en RT en la oscuridad. Incubar todos los tubos con tinción de anticuerpos durante 30 minutos en RT en la oscuridad. Tome los tres tubos para el control no manchado (ver 12.4) y el pellet resuspend en 250 l de tampón FACS. Manténgase en hielo. Después del tiempo de incubación, lave todos los tubos excepto los controles no manchados una vez con el tampón FACS como se describe en 12.7. Resuspender el pellet en 250 l de tampón FACS y adquirir datos sobre el citómetro de flujo. Utilice celdas no manchadas para la configuración negativa y las perlas del ratón de compensación para ajustes positivos en el software FACS. Además, utilice FMO para controlar la estrategia de medición, donde FMO-CD41 se utiliza en el panel MPA, FMO-CD62P se utiliza en el panel PA y FMO-CD162 se utiliza en el panel LI. Adquirir casi 0,5 x 106 – 0,25 x 106 eventos por tubo para FACS. Guarde los datos y analice con un software de análisis (versión 9.9.6).

Representative Results

Todos los datos presentados, excepto las gráficas FACS, fueron analizados con un software de estadísticas. Las gráficas FACS se analizaron utilizando software de citometría de flujo. El análisis del recuento completo de células sanguíneas no mostró diferencias significativas con respecto a los eritrocitos entre todas las condiciones analizadas (Figura 2). Sin embargo, las plaquetas y los leucocitos se redujeron drásticamente en el grupo de látex, lo que indica una muy mala biocompatibilidad del látex. Esto se subraya además por el aumento de los niveles de hemoglobina libre en el grupo de látex, lo que indica el hecho de que, a excepción del grupo de látex, ninguno de los otros dispositivos vasculares o condiciones condujo a una hemólisis extensa (Figura 2). Además, los tubos recubiertos de PVC, poliPVC y hepPVC, así como el stent probado no condujeron a la trombosis por medio de la pérdida de plaquetas y leucocitos, mientras que el látex exhibió la mayor pérdida de plaquetas y leucocitos, seguido de tubos de PVC sin recubrimiento que mostraron una tendencia disminuida. Mientras que todos los dispositivos vasculares probados condujeron a una mayor activación del sistema de coagulación (FPA) y al componente de complemento (sC5b-9), los bucles hepPVC mostraron una tendencia a la disminución de los niveles de FPA y sC5b-9 en comparación específicamente con los bucles polyPVC(Figura 3). Curiosamente, los bucles de PVC y Gap sin recubrimiento mostraron niveles más bajos de FPA en comparación con polyPVC, aunque no alcanzando el nivel de significancia estadística. Sin embargo, los bucles de látex mostraron niveles significativamente mayores de FPA en comparación con las condiciones basales y estáticas. De acuerdo con el recuento completo de células sanguíneas, los bucles de látex presentaban los niveles más altos de TNF, IL-6 y PMN elastase (Figura 4), alcanzando el nivel de significancia estadística en comparación con el resto de los grupos en términos de TNF e IL-6(Figura 4A,B), mientras que a las condiciones estáticas y basales en términos de la elastasa PMN (Figura 4C). Estos resultados indican la potente activación de leucocitos por látex. Los niveles basales de los marcadores de activación siempre fueron comparables a las condiciones estáticas, lo que indica una heparinización adecuada de la sangre. Curiosamente, se demostró que los recuentos de plaquetas y leucocitos para bucles inducidos por brecha sólo se redujeron ligeramente con la activación moderada del sistema coagulatorio (FPA) y leucocitos (PMN elastasa), aunque el cierre incorrecto del bucle con turbulencias de flujo resultantes y el contacto sanguíneo a la superficie rugosa no revestida y cortante condujo a coágulos macroscópicamente visibles en el empalme(Figura 1F). Los coágulos y su distribución a lo largo de toda la superficie del empalme eran evidentes con las imágenes de TCT y SEM, mientras que no se encontró ningún coágulo cuando los bucles se cerraron con el dispositivo de cierre externo sin dejar ningún espacio entre las terminaciones del bucle (Figura 5). El análisis citométrico de flujo de las células sanguíneas del huésped que se tiñeron con marcadores específicos de plaquetas, CD41 y el marcador de activación plaquetaria CD62P, se muestran en la Figura 6A,B. Aquí, los tubos de látex presentaban una intensidad de fluorescencia media extremadamente alta (IMF) para CD62P en las plaquetas sanguíneas, seguidos de stent, mientras que los tubos de poliPVC recubiertos de heparina presentaban una activación mínima de las plaquetas que representaban la propiedad antitrombógena de los tubos poliPVC. Además, los leucocitos se clasificaron sobre la base de la granularidad basada en CD45 y SSC (dispersión lateral) en (i) granulocitos; (ii) monocitos y iii) linfocitos(Figura 7),y la expresión de CD162+ integrina se detectó en cada subpoblación de leucocitos que se sabe que interactúan con el CD62P en las plaquetas24. Se notó que las expresiones de integrina se redujeron drásticamente en granulocitos y linfocitos en bucles de látex. Este resultado estuvo en línea con los niveles reducidos de frecuencias totales de leucocitos en los bucles de látex (Figura 2). En general, los niveles de integrina fueron más altos entre los monocitos en comparación con los granulocitos y linfocitos, lo que indica la probabilidad de que la interacción monocitos con plaquetas activadas. A este respecto, también se evaluaron los agregados plaquetarios monocitos manchando las células sanguíneas con CD14 (como marcador de monocitos) y CD41 (como marcador plaquetario) y, en última instancia, para identificar células dobles positivas, es decir, CD14+CD41+MPA (Figura 8). Aquí, notamos que el grupo stent exhibió los niveles más altos de expresión CD41 en la MPA, seguido por el grupo de látex, lo que indica una mayor tendencia a formar MPA, a pesar de la frecuencia reducida de monocitos (<1 %) en los bucles de látex. Figura 1: Visión general del modelo de bucle hemodinámico in vitro y sus modificaciones. (A) Bucle para el experimento de separación con el sistema de cierre de bucle externo, sin dejar ningún hueco en el empalme. (B) Lazo hecho de tubo de PVC recubierto de poliPVC y stent interior (flecha). (C) Lazo de tubo de látex. (D) Bucle para el experimento de separación sin el sistema de cierre de bucle externo dejando un espacio entre las terminaciones de tubo (flecha). (E) Bucles colocados en la base del lazo dentro del baño de agua y llenos de sangre. (F) Thrombus dando como resultado un hueco en el empalme (flecha) después de la rotación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Resultados para el recuento de células sanguíneas y hemoglobina plasmática. (A) Cuentan los eritrocitos. (B) Recuento de plaquetas. (F) Cuentan los leucocitos. (D) Hemoglobina plasmática libre. Los resultados indican la mala biocompatibilidad del látex, lo que conduce a una hemólisis excesiva. Los datos se presentan como valor medio; las barras de error indican SEM. n.o 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Resultados para la activación del sistema de coagulación y complemento. (A) Activación del sistema de coagulación, medida por los niveles de Fibrinopéptido A (FPA) (B) Activación del sistema de complemento, medida por niveles de sC5b-9. Mientras que los tubos de látex evocaban niveles elevados significativos del FPA, la activación del complemento fue fuerte para todos los materiales probados. Los datos se presentan como valor medio, las barras de error indican SEM. *p<0.05, n-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Marcadores de activación de leucocitos. (A) Factor de necrosis tumoral alfa (TNF). (B) Interleucina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Los resultados indican una mayor activación de leucocitos debido a niveles elevados de los marcadores analizados, seguidos de bucles stent, que sólo condujeron a mayores niveles de PMN Elastase pero no TNF o IL-6. Los datos se presentan como valor medio, las barras de error indican SEM. *p<0.5; **p<0.01, n.o 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Imagen del empalme de los bucles. (A) tomografía μ-ordenador (-TC) de bucles con cierre incorrecto (brecha). Las áreas rojas indican material trombo. (B) Representación del lado luminal del tubo. La selección rectangular indica el área para escanear microscopía electrónica (SEM) (C). (D) de bucles con dispositivo de cierre de bucle externo y sin separación en el empalme, y (E) renderizado y vista de la superficie luminal. No se encontró material de trombo. (F) Imagen SEM de la selección rectangular en (E). No se encontró material de trombo en la superficie de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Gráfica FACS para activación plaquetaria (CD62P). (A) Gráfica representativa FACS (condición básica) que muestra la sangre CD41+ plaquetas. (B) Gráfico que muestra el estado de activación plaquetario reflejado por la intensidad media de fluorescencia (IMF) de los diferentes tipos de dispositivos vasculares en comparación con las condiciones estáticas RT y basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Gráfica FACS para leucocitos integrin (CD162). (A) Gráfica representativa del FACS (condición básica) que muestra la sangre CD45+ leucocitos y subgrupos (B) Gráfico que muestra el leucocitos CD162+ intensidad media de fluorescencia (FIN) de los diferentes tipos de dispositivos vasculares en comparación con las condiciones estáticas y basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Gráfica FACS para agregados de monocitos plaquetarias (CD41/CD14). (A) Gráfica representativa de FACS (condición básica) que muestra el gating para monocitos sanguíneos (CD45+/CD14+), plaquetas (CD41+) y agregados plaquetarios monocitos (CD41+/CD14+) (B) Gráfico que muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) cd41+ en agregados plaquetas monocitos para los diversos dispositivos vasculares en comparación con la línea de base y las condiciones basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este estudio ha demostrado que el modelo de bucle hemodinámico in vitro presentado ofrece un método fiable para probar la compatibilidad sanguínea in vitro de dispositivos médicos de acuerdo con la norma ISO 10993-4.

Los pasos críticos en el protocolo incluyen el dibujo de sangre y el llenado de los tubos con sangre, donde se debe evitar el vacío excesivo o la agitación para evitar que los componentes sanguíneos se activan por el procedimiento de manipulación. Además, es muy importante congelar inmediatamente las muestras de plasma y mantenerlas sobre hielo después de la descongelación, ya que el complemento y la activación del sistema de coagulación pueden ser manipulados manteniendo las muestras a temperatura ambiente durante más tiempo.

Dado que este modelo tiene méritos y deméritos en comparación con otros modelos in vitro, hay que tener en cuenta varios factores al diseñar los experimentos.

En primer lugar, los bucles se pueden variar en longitud y diámetro para adaptarse a varias configuraciones experimentales. En caso de que la configuración incluya tubos de contraste de diferentes diámetros interiores, debe tenerse en cuenta que las diferencias de diámetro darán lugar a diferentes fuerzas de cizallamiento, afectando así a la coagulación y complementar la cascada7. En segundo lugar, la velocidad de rotación se estableció en 30 rpm en este experimento. Esto dará lugar a un flujo sanguíneo de aproximadamente 25 cm/s, que es comparable a la velocidad del flujo sanguíneo en los injertos de bypass de la arteria coronaria humana25. La tasa de deformación unitaria, generada por la rotación de los bucles, es el parámetro principal que iniciará cascadas bioquímicas de componentes sanguíneos, incluidas las células y las proteínas libres de células. Pero como la sangre es un fluido no newtoniano, la tasa de tensión también se verá influenciada por la curvatura del tubo, respectivamente, la longitud de los tubos que están cerrados a los bucles10. Siempre que se cambia la velocidad de rotación o el tamaño del bucle, es importante tener en cuenta que la correlación entre la velocidad de deformación unitaria y la velocidad de rotación no es lineal. La correlación entre la velocidad de rotación y la tasa de deformación unitaria no se examina suficientemente hasta hoy y se requieren más estudios para investigar estos parámetros particulares10,26,27. Sin embargo, basado en un modelo para la capa límite laminar, el diámetro de tubo dado de 5 mm y la velocidad de rotación de 25 cm/s, una estimación aproximada de la tensión de cizallamiento de la pared (WSS) indicaría valores entre 2,20-22,00 pascal para una distancia de 1,00-0,01 mm a la pared del tubo cuando se estima que la densidad de sangre es de 1060 kg*m-3 y la viscosidad cine kinetical se establece en 0.0025 pascal*s28,29. Curiosamente, también un análisis computacional más detallado de la dinámica de flujo en la curvatura de las arterias coronarias humanas mostró valores WSS que van desde 11.33 a 16.77 pascal a parámetros aproximadamente comparables para la velocidad, densidad y viscosidad de la sangre30.

Además de esta limitación, el modelo de bucle presentado es un sistema de presión menos, que no imita las relaciones de presión arterial intravasculares del sistema vascular humano.

La siguiente limitación importante es que la sangre está en contacto con el aire dentro de los bucles, lo que trae interferencias adicionales. Tal contacto sangre-aire se ve afectado por dos parámetros, que incluyen la permeabilidad al gas de los tubos y la retención de aire dentro de los bucles mientras se llenan de sangre. Cada material de tubo posee una cierta permeabilidad al gas que puede conducir a cambios significativos en las concentraciones de gas dentro de los tubos. Si bien algunos autores afirman que el efecto resultante de la permeabilidad del gas en la activación de los componentes sanguíneos sigue siendo poco claro31,se sabe que la función de los coaguladores de la sangre es altamente sensible a un pH-shift, que puede ser causado por la difusión de CO2 32,33,34. Aquí, hemos probado la biocompatibilidad de los tubos de perfusión sanguínea en condiciones de aire interior, comparables a los escenarios clínicos de perfusión extracorpórea de sangre. Para futuras mejoras del modelo presentado, la incubación de todo el modelo en una incubadora deCO2 y la realización de la validación del pH de la sangre antes y después de la incubación podrían ser útiles para estandarizar aún más este modelo.

Además, la interfaz sangre-aire dentro de los bucles puede conducir a la activación de proteínas plasmáticas y fracciones celulares de la sangre35,36. Los dispositivos accionados por bomba de rodillos sin aire dentro de los tubos pueden evitar el problema de la interfaz sangre-aire, pero sin duda inducen daños a las células sanguíneas con niveles elevados significativos de hemoglobina en comparación con el modelo de bucle aquí presentado, y la hemoglobina en plasma puede interferir con la sensibilidad de los analitos analizados en ELISA16. En este estudio hemos demostrado que el efecto hemolítico del propio modelo de bucle sigue siendo mínimo mientras se utilizan materiales biocompatibles como tubos de PVC recubiertos de heparina. Por lo tanto, el modelo no está causando daños celulares excesivos en comparación con los modelos impulsados por bombas, sino por otro lado induciendo proteínas plasmáticas debido al contacto con el aire sanguíneo. Cabe destacar que van Oeveren et al. desarrollaron un modelo de bucle basado en válvulas de bola evitando el aire dentro de los bucles16. Esta prometedora alternativa al modelo de bucle aquí presentado puede superar el problema de la interfaz de aire sanguíneo, sin embargo, en comparación con el modelo presentado aquí, la adhesión plaquetaria es aún mayor para el modelo de bucle basado en válvula de bola.

Con respecto al control estático, cabe señalar que el propio vidrio ha demostrado ser un potente activador del sistema coagulatorio37. Sin embargo, en la configuración presentada, la incubación en un vaso de precipitados de vidrio (control estático) no condujo a la activación excesiva de la célula huésped o la activación del sistema coagulatorio en comparación con los niveles basales directamente después de extraer la sangre. En conclusión, podría ser útil utilizar, por ejemplo, tubos de polipropileno, si el control estático muestra altos niveles de activación.

Independientemente de si se trata de un bucle basado o un modelo impulsado por bomba, estos modelos in vitro carecen por completo de las interacciones biológicas auténticas que son aportadas principalmente por un endotelio intacto, que es una superficie de contacto de sangre ideal. La razón detrás de este problema es más evidente cuando se está probando un dispositivo médico como un stent, lo que podría impartir diferentes resultados, en términos de activación y proteínas plasmáticas, durante su interacción con los componentes sanguíneos en presencia de endotelio. Esto declara ser un inconveniente importante de todos los sistemas in vitro discutidos que imitan el sistema circulatorio. Por lo tanto, para superar este problema, los nuevos sistemas microfluídicos que están completamente cubiertos con endotelio están ganando un interés inmenso, pero sin embargo en comparación con el modelo de bucle presentado aquí, todavía se limitan a acomodar volúmenes sanguíneos más pequeños y caudales mínimos38,39

Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el modelo Chandler Loop sigue siendo un modelo robusto para la realización de pruebas estandarizadas sobre la biocompatibilidad sanguínea de dispositivos médicos vasculares en el campo de la investigación cardiovascular.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores están agradecidos a la Sra. Elena Denks por su asistencia técnica.

Materials

5 ml tube, K3 EDTA Sarstedt 32332
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set Becton Dickinson BioSciences 552843
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512
BD LSR Fortessa II cell analyzer Becton Dickinson 647465
BD Vacutainer Citrate Tubes Becton Dickinson 369714
BD Vacutainer one-use holder Becton Dickinson 364815
BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G Becton Dickinson 367282
Beaker glass ROTILABO short 10 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X686.1
Beaker glass ROTILABO short 50 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X688.1
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody BioLegend 328808
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody BioLegend 303730
Centrifuge ROTINA 420 | 420 R Hettich Zentrifugen 4701 | 4706
Centrifuge tubes, 50 ml Greiner Bio-One GmbH 227261
CHC Super modified, 5mm PVC tubing Corline Sweden 1807-148 Referred to as hepPVC tube
Circular Precision Cutter ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 007-20
Closing Unit (complete with tension bands) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 008-20
Electric tape Scotch Super 33+ VWR MMMA331933
ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 BioLegend 430504
ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a BioLegend 430204
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray Eppendorf AG 3123000012
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray Eppendorf AG 3123000020
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow Eppendorf AG 3123000047
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue Eppendorf AG 3123000063
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow Eppendorf AG 3123000055
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet Eppendorf AG 3123000071
Ethylenediaminetetraacetic acid solution Sigma-Aldrich 03690-100ML
FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom Corning BV 352052
Fetal bovine serum Gold Plus Bio-Sell FBS.GP.0500
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 367116
Fluency plus stent 13.5 x 60 mm Angiomed GmbH & Co FVM14060
Free Hemoglobin fHb Reagent Bioanalytics GmbH 004001-0250
Gibco PBS Tablets Thermo Fisher Scientific 18912014
Gloves Vasco Nitril white L B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208437
Gloves Vasco Nitril white M B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208429
Glutaraldehyde 25% aequous solution Sigma Aldrich G6257-100ML
Heparin, 25.000 IE in 5 ml Rotexmedica, Trittau, Germany PZN 3862340
Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit Hölzel Diagnostika abx253234
Kodan tincture forte colourless Schülke & Mayr GmbH 104012
Latex tube, ID 5 mm Laborhandel24 GmbH 305 0507
Loop Stand ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 009-20
Medimex venous tourniquet classic ROESER Medical GmbH 310005
Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex Tecan TEC006418I
Microplate shaker PMS-1000i VWR 444-0041
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm VWR NALG8703-0508 Referred to as PVC tube
NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer Medical Indicators 2112-20
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated BioLegend 423501
Osmium tetroxide solution Fisher Scientific 10256970
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
PE anti-human CD16Antibody BioLegend 302008
PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody BioLegend 304906
Pipette controller, pipetus VWR 612-1874
Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 – 5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5186480
Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 – 10µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 9409410
Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 – 200µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.870
Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 – 1000µl blue Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.919
PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit Fisher Scientific BMS269
Probe stand ROTILABO combi CARL ROTH K082.1
Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 011-20
RBC Lysis Buffer (10X) BioLegend 420301
Reagent reservoirs VWR 613-1184
Rotation Unit ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 010-20
Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409320
Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409331
sc5b9 Human ELISA KIT TECOmedicalGroup A029
Scalpel no 10 Fisher Scientific NC9999403
Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG Philips n.a.
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X715.1
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X714.1
Semi-micro cuvette 1.6 ml Sarstedt 67.746
Serological pipette 10.0 ml Corning BV 4488
Serological pipette, 25.0 ml Corning BV 4489
Serological pipette, 5.0 ml Corning BV 4487
Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm VWR BURK8803-0812
Sprout mini centrifuge Biozym 552034
Stop Solution for TMB Substrate BioLegend 77316
Swabs, sterile Fuhrmann GmbH 32055
Syringe, 10 ml Becton Dickinson 300296
Temperature controlled water basin ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 020-20
tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics Fisher Scientific 10000730
TMB Substrate Set BioLegend 421101
Trillium PVC tube, 5 mm ID Medtronic 161100107100103 Referred to as polyPVC tube
Tween 20 AppliChem A4974,0250
UV-Vis Spektrometer Lambda 2 Perkin Elmer 33539
Vornado Mini Vortexer Biozym 55BV101-B-E
XN-3000 workstation blood analyzer Sysmex Europe n.a.
μ-CT Phoenix Nanotom S GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany n.a.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices – Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
  2. Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
  3. Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
  4. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  5. Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
  6. Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
  7. Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
  8. Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
  9. Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
  10. Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
  11. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
  12. Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
  13. Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), 355 (2017).
  14. Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
  15. Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
  16. van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
  17. Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
  18. Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
  19. Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
  20. Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
  21. Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
  22. Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
  23. Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
  24. Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
  25. Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
  26. Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
  27. Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
  28. Böswirth, L. . Technische Strömungslehre. 8 edn. , (2010).
  29. Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
  30. Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
  31. Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
  32. Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
  33. Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
  34. Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
  35. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
  36. Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
  37. Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
  38. Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), 18 (2019).
  39. Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).

Tags

In Vitro Hemodynamic Loop ModelHemocytocompatibilityHost Cell ActivationVascular Medical DevicesPerfusion TubingsStentsBlood CompatibilityTube CutterTension Band ConnectorStent Loop AssemblyLoop CradleRotation UnitHeparinBlood CollectionHomogenous SolutionBlood FillingLoop Rotation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wacker, M., Betke, U., Borucki, K., Hülsmann, J., Awad, G., Varghese, S., Scherner, M., Hansen, M., Wippermann, J., Veluswamy, P. An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices. J. Vis. Exp. (162), e61570, doi:10.3791/61570 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image