מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של בית החולים האוניברסיטאי מגדבורג (בקשה מספר 88/18) והנבדקים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב לפני הליך רישום הדם. 1. הכנת מניות הפרין ותדגמת דם חשב את כמות הדם הדרושה לכל הניסויים.הערה: כמעט, 5 מ”ל של דם heparinized נדרש עבור כל מכשיר כלי דם בכפילויות (לולאות). כמו כן, 5 מ”ל של דם נדרש עבור כל מצב בסיסי וסטטי אשר נשמר בצד בטמפרטורת החדר. הכן פתרון מלאי הפרין בריכוז של 100 IU/mL על ידי דילול הפרין שלא שנפרא (למשל, Rotexmedia) במים deionized. השתמש 150 μL של פתרון זה עבור heparinization של דם טרי 10 מ”ל. לחשב את כמות הדם, כמו גם פלזמה הדרושים לספירת תאי דם שלמים, ELISA ו FACS assays.הערה: המדידות המיוצגות במחקר זה מתקבלות משתי לולאות הפועלות במקביל (אחת ככפילה) עם נפח דם כולל של 10 מ”ל. בהתבסס על הכמות הנדרשת של דם, למלא מזרקים 10 מ”ל עם 150 μL של תמיסת מלאי הפרין כדי למנוע קרישה בדם עם ריכוז הפארין הסופי של דם 1.5 IU/mL. יש דם באמצעות פרפר (גודל: 21 גרם). מלא את המזרקים בעדינות רבה כדי למנוע המוליזה או הפעלת תאים בשל ואקום מוגזם.הערה: יש לקבל אישור מוועדת האתיקה המקומית לפני תחילת הניסויים. קבל הסכמה מדעת מכל תורם דם אנושי. ודא כי תורם הדם הוא בריא ולא לוקח תרופות, במיוחד אין חומרים נגדplatelet או תרופות אנטי דלקתיות שאינן סטרואידיות לפחות 10 ימים לפני הניסויים. הערה, אותו תורם מועדף בעת השוואת סוגים שונים של מכשירי כלי דם בפעם הראשונה כפי שמוצג בכתב יד זה. כדי להעריך עוד יותר את ההבדלים הבין-אינדיבידואליים, ניתן לחזור על הפרוטוקול עם תורמים שונים. לאסוף דם ב זכוכית, למנוע תסיסה מוגזמת. 2. בהרכבת לולאה המודינמית במבחנה ממלאים את אמבט המים עד שמפלס המים מגיע למרכז יחידת הסיבוב. הגדר את טמפרטורת המים ל-37°C. מכלול לולאה לבדיקת חומרי צינורות שונים (polyPVC, hepPVC, PVC ולטקס) חותכים שתי חתיכות באורך 50 ס”מ של כל חומר צינור (קוטר פנימי 5 מ”מ) עם חותך הצינור. ודא כי משטח החיתוך הוא שטוח, כמו זה חשוב במיוחד עבור סגירה מושלמת עבור לולאות עם קטרים קטנים, כך הדם זורם ללא כל עיוות על הקצה הולם.הערה: פרוטוקול זה כולו משתמש בצינורות בקוטר פנימי של 5 מ”מ. כדי להקל על הטיפול ולהימנע מהשהיה לאחר עיבוד לאחר הסבב, הפעל רק ארבע לולאות (2 חומרים בכפילויות) במקביל. כדי ליצור צורת לולאה, חבר את הסוף הפתוח של הצינורות לפיסה קצרה של צינור סיליקון המתאימה לקצר הפנימי של צינור החקירה. השתמשו בתחבושות המתח הפוליקרבונטיות כדי להבטיח סגירה נכונה של הלולאות. כאשר נעשה שימוש בפעם הראשונה, להתאים את אורך הלהקות כדי להתאים את הקוטר הפנימי של הלולאה על ידי חיתוך רצועה מתח עם מספריים באורך הנדרש ולאבטח אותו עם מפתח ברגים מומנט 3 מ”מ. הדק בזהירות את בורג הנעילה של מחבר רצועות המתח תחת בדיקה של סופי הצינור. כוונן את כוח הסגירה כך שלא יישאר פער בין סופי הצינור. אם בורג הנעילה מהודק לחלוטין והמתח של רצועה פוליקרבונט נראה נמוך מדי כדי לסגור את הפער בין סופי הצינור, לפתוח את הנעילה של המערכת ולחתוך כמה מ”מ של רצועה מתח. חזור על כך, עד להשגת סגירת לולאה מדויקת(איור 1A). אם חומר הצינורות רך מאוד ונוטה להחליק לתוך רצועות המתח, לתקן את הלולאה עם סרט חשמלי לרצועה מתח(איור 1B,C). הכן לולאה נוספת של PVC לבקרת טמפרטורה עם ממדים זהים לזה של לולאות הבדיקה. אבטחו את הלולאות בעריסה הלולאה של יחידת הסיבוב מחוץ לאמבט המים. לאחר מכן, לחבר את עריסת הלולאה ליחידת הסיבוב בתוך אמבט המים(איור 1E). לפרק את רצועה מתח חלקית מן הלולאות ולנתק קצה אחד של כל צינור כדי לפתוח את הלולאה. למלא בעדינות כל לולאה עם 5 מ”ל של דם עם פיפטה סרולוגית 5 מ”ל. מערבבים דם בעדינות פעמיים בשכבת הזכוכית על ידי התזת באיטיות למעלה ומטה לפני הטעינה לתוך הלולאות. קח את המדחום החד פעמי והניח אותו בתוך לולאת בקרת הטמפרטורה. אם המדחום גדול מדי, לחתוך אותו עם מספריים כדי להתאים צינורות קטנים יותר. מלאו את הלולאה ב-5 מ”ל של מים שהם דלים בטמפרטורת החדר. סגור את הלולאות ווודא אם הלולאות, רצועות המתח והמדף מותאמים כראוי. הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סיבובים לדקה (סל”ד) וסובב למשך 3 שעות. הרכבת לולאה לבדיקת ההשפעה של סגירת לולאה לא תקינה (פער) הכן ארבע לולאות (polyPVC) כמתואר ב- 2.2. סגור שתיים מהלולאות כראוי עם רצועות המתח ולהימנע מכל פער בין סופי הצינור. עבור שתי הלולאות האחרות לחבר את הסוף הפתוח לתוך הצינור גדול יותר כמתואר ב 2.2.3, אבל להשאיר פער של 1-2 מ”מ בין סיומת הלולאה. אין להשתמש ברצועות המתח עבור לולאות אלה(איור 1D). הכן לולאת בקרת טמפרטורה אחת כמתואר ב- 2.2.7 ו- 2.2.11. מלא את כל הלולאות בדם כמתואר ב- 2.2.10. הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סל”ד וסובב למשך 3 שעות. מכלול לולאה לבדיקת סטנט הכן ארבע לולאות כמתואר ב- 2.2 ולאחר מכן.הערה: כדי להעריך את תאימות הדם של סטנטים, החומר צינור עצמו צריך להיבדק להיות תואם ביולוגית על מנת למנוע מיסוכת של הפעלת התא. אם לא קיימים נתונים, ניתן לבדוק את חומר הצינור עצמו כמתואר ב- 2.2. יתר על כן, ניתן להחיל את טווח הקוטר בתוך סטנט (ראה הוראות היצרן) וצריך להתאים את הקוטר הפנימי של חומר הצינור. פתח שתיים מהלולאות והצא את הצינור ממערכת רצועות המתח. הכנס את סטנט לאמצע הצינור בהתאם להוראות היצרן. השתמש בשתי הלולאות האחרות ללא סטנט כפקד. מלא את כל הלולאות בדם כמתואר ב- 2.2.10. הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סל”ד וסובב למשך 3 שעות. בקרת טמפרטורה בכל עת במהלך וכאשר הסיבוב נעצר, הטמפרטורה של הדם בתוך הלולאות מסומן על ידי המדחום בתוך לולאת בקרת הטמפרטורה. כדי לקרוא את הטמפרטורה, לעצור את הסיבוב ומיד לקרוא את הטמפרטורה המצוינת על ידי המדחום. 3. עיבוד דגימת דם לאחר הסיבוב, תן לולאות לעמוד בארון במשך 2 דקות במיקום כלפי מעלה כדי לאפשר לדם לצבור בתחתית הלולאות, הימנעות כל שפיכה בעת פתיחת הלולאות. בדוק את הדם שנותר לתנאים סטטיים: אם הדם הזה הוא קרישה, הפריניזציה לא תקין הוא בסופו של דבר חשוד. במקרה זה, חזור על הניסוי רצוי גם עם תורם דם אחר. בזהירות להוציא את הלולאות מהמדף. פתח את המחברים ותן לדם לזרום לתוך זכוכית של 10 מל. תסוגר את הדם מהצינורות שמרוצים בכפילויות. יש לשאוב דם טרי לניתוח בסיסי מאותו תורם כפי שתואר ב-1.5 וב-1.6. אוסף של דם ציטראט נתרן לאוסף של דם ציטראט נתרן, למלא ארבעה צינורות 1.5 מ”ל, כל אחד עם 111 μL נתרן ציטראט פתרון שנאסף מצינורות נתרן ציטראט, כדי ליצור ריכוז סופי של 3.2% של נתרן ציטראט. מלא כל שפופרת ב-1 מ”ל דם מזכוכיות הזכוכית כמתואר ב-1.6 וב-3.3. שמור את הדם בטמפרטורת החדר והשתמש בדם זה לניתוחי FACS כמתואר ב- 12.הערה: כדי לשנות את אורך הלולאות עבור הגדרות ניסיוניות שונות, תכנן כראוי aliquots בהתבסס על כמות המידות שיש לבצע. ייתכן שיהיה צורך לקבוע את כל המדידות הנדרשות עם דם טרי לפני הניסויים האמיתיים כדי להבטיח את נפח הדם לולאות מספיק עבור כל המדידות. אוסף של חומצה אתילנדיאמין טראסטית (EDTA) דגימות דם ופלזמה. מכל זכוכית עם דם (ראה 1.6 ו 3.3) להעביר 4.5 מל של דם לתוך צינור EDTA אחד 5 מל. מלאו שתי צינורות EDTA מכל זכוכית של 10 מל בדם. מערבבים בעדינות את הדם ולשמור אותו על קרח. להעביר 2 מ”ל של דם לתוך צינור צנטריפוגציה נעילה 2 מ”ל ולהשתמש בדם זה לספירת תאי דם ומדידה המוגלובין חינם כמתואר ב 5. ו-6. צנטריפוגה הדם הנותר ב 3,500 x גרם במשך 20 דקות. בזהירות לאסוף את הפלזמה supernatant ב 500 μL aliquots ומיד להקפיא ב -80 °C. 4. סריקת מיקרוסקופאלקטרונים ותמונות μCT לאחר עיבוד דגימת דם, לשטוף את הלולאות הרוקנות שהוכנו כמתואר ב 2.3 עם 10 מ”ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כל אחד. בזהירות לחתוך דגימה באורך 1 ס”מ מכל קצה של כל צינור עם אזמל. דגירה מדגם לילה ב 4 ° C בתמיסה גלוטראלדהייד 2%.התראה: שאיפת אדי אלדהיד יכולה לגרום לתסמיני אף כגון מחניק מתמיד של עפרות נזלת וגירוי בדרכי הנשימה, ומגע עם העור גורם לדלקת עור. יש לטפל באלדהידות בכיפה בזמן שהן לובשות כפפות, שמלת מגן ומגף בטיחות. לשטוף את המדגם (3 פעמים) עם PBS. הכן תמיסה של 1% של אוסמיום טטרוידיד (OsO4)במים deionized ודגירה מדגם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.התראה: OsO4 הוא סוכן חמצון חזק, זה יכול להיות מופחת על ידי חשיפה לאור. כדי למנוע הפחתה במהלך ההכנה, לאחסן OsO4 בבקבוק זכוכית חום. OsO4 הוא הפכפך מאוד, האדים שלו רעילים לעיניים, האף והגרון. תמיד לעבוד תחת מכסה המנוע אדים ולהשתמש בכפפות ולהגן על בגדים, להבטיח כי שום חלק של הגוף אינו חשוף OsO4. פנה להנחיות המוסד בנוגע לטיפול בפסולת ובאחסון. באופן כללי, OsO4 הוא לאחסון במשך כמה חודשים, אבל זה צריך בקבוקי זכוכית מיוחדים עם ליינר טפלון ויריד, כי OsO4 יכול לדהות משטחים פנימיים ותכולת המקרר בנוכחות אדים דולפים. להוציא דגימות, להעביר אותם בצינורות צנטריפוגה חדשים 15 מ”ל ולשטוף דגימות 3 פעמים עם PBS. הכן סדרה של אתנול עם ריכוזים שונים (25%, 50%, 75%, 95%, 100%) דגימות התייבשות באתנול: דגירה במשך 20 דקות כל אחד ב-25%, 50%, 75% ו-90% ו-30 דקות ב-100%. קח דגימות מתוך 100% אתנול ולתת לו אוויר להתייבש לילה בטמפרטורת החדר. בדוק דגימות במיקרוסקופ האלקטרונים הסריקה במתח האצה של 5 kV ועם סורק μCT רנטגן. 5. ספירת תאי דם קח 2 מ”ל של דם EDTA שהושג כמתואר ב 3.7.3 הכנס את הצינור למנתח ההמטולוגיה האוטומטי ובצע את הוראות היצרן. 6. מדידה של המוגלובין חינם (fHb) בפלזמה להפשיר דגימת פלזמה אחת מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. לאחסן על קרח לאחר הפשרה.הערה: תמיד להפשיר דגימות פלזמה קפואות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס ומיד להעביר לקרח, המכיל קצת מים, כדי להוריד את הטמפרטורה. חשוב להימנע מהפעלה של רכיבי דם במהלך הפשרה. השתמש בריגנט fHb ובצע את הוראות היצרן. הימנע מזיהום לאחר הפתיחה והגן על הריגנט מפני אור ישיר (שמש, אור UV). השתמש ב- ערכת pipetting (ראה הוראות היצרן) עם דילול של 1:5. הוסף 1000 μL של reagent המוגלובין ב 1.6 מ”ל חצי מיקרו cuvette. השתמש בקובט זה כדי לקבוע את הערך הריק. להוסיף 1000 μL של reagent המוגלובין ו 250 μL של דגימת פלזמה ב cuvette חצי מיקרו אחר. מערבבים את התוכן בשתי הקוביות על ידי שטיפה יסודית של הפיפטה על ידי מילוי חוזר ונשנה בתערובת התגובה, ותדגם לפחות 3 דקות בטמפרטורת החדר. לקבוע את ההכחדה (E) של הדגימה נגד reagent fHb כמו ריק ריק reagent. חשב את ריכוז ה-fHb (mmol/l) של הדגימה: E540-E680 x 0.452. 7. מדידה של FPA להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה. השתמש בערכת FPA Elisa ובצע את הוראות היצרן. 8. מדידה של sC5b9 להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה. השתמש בערכת ה-SC5b-9 ELISA ובצע את הוראות היצרן. 9. מדידה של PMN להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה. השתמש ערכת PMN-Elastase ELISA ובצע את הוראות היצרן. 10. מדידה של TNF יש לצופה במיקרו-לוחיות יום אחד לפני הפעלת ה-ELISA. לציפוי, להוסיף 100 μL של תמיסת נוגדנים ללכוד לכל בארות, צלחת אטום דגירה לילה ב 2 ° C-8 ° C. להפשיר דגימת פלזמה אחת מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. לאחסן על קרח לאחר הפשרה. השתמש בערכת TNF ELISA ובצע את הוראות היצרן. 11. מדידה של IL-6 מיקרו-לוחיות רישוי חייבות להיות מצופה בתרופות לכידה יום אחד לפני הניסוי. לציפוי, להוסיף 100 μL של תמיסת נוגדן ללכוד לכל בארות של המיקרופלטה המסופקת עם הסט, צלחת אטום דגירה לילה ב 4 ° C להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. ולאחסן על קרח לאחר הפשרה. השתמש בערכת IL-6 ELISA ובצע את הוראות היצרן.. 12. ניתוחי FACS הכן 500 מ”ל של מאגר FACS על-ידי הוספת 10 מ”ל של סרום עגל עוברי ו-2 מ”ל של תמיסת EDTA (0.5 M) ל-488 מ”ל של PBS אחד. ניתן לאחסן את מאגר FACS למשך 4 שבועות ב- 4°C. השתמש 100 μL של דם ציטראט נתרן (ראה 3.6.3) עבור כל הליך כתמים (אגרגטים טסיות דם מונוציט (MPA), הפעלת טסיות דם (הרשות הפלסטינית), integrins leukocyte (LI).). פיפט 100 μL של דם מכל דגימה לתוך צינור FACS 5 מ”ל. מכל דוגמה, הכינו 3 צינורות להכתמת נוגדנים ותווית עם לוח MPA (צבירה של טסיות דם מונוצייט), פאנל PA (צבירה טסיות דם) ולוח LI (leukocyte integrin). מערבבים את שאר 4 הדגימות לצינור FACS אחד של 5 מ”ל. השתמש בתמהיל זה עבור פקדים לא מוכתמים ופלואורסץ פחות פקד אחד (FMO). להכין 6 צינורות FACS על ידי pipetting 100 μL של הדם המדגם מעורב לתוך כל צינור. תווית 3 צינורות כמו לא מוכתם ו 3 צינורות כמו FMO-CD41, FMO-CD62P ו FMO-CD162. מוסיפים 100 μL של 4% תמיסת paraformaldehyde ותדנוד במשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.התראה: Paraformaldehyde רעיל לעור ולעיניים. זה יכול לגרום לגירוי ריאתי חמור כאשר שואפים והוא יכול להוביל לנזק לריאות לאחר חשיפה ממושכת. יתר על כן, הוא מסווג כמסרטן ורעלן רבייה. תמיד ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות ולעבוד מתחת למכסה המנוע אדים. הוסף 1 מ”ל של מאגר כביסה לכל שפופרת וצנטריפוגה ב 287 x g במשך 5 דקות. בטל את שלב השטיפה וחזור פעמיים. עבור תאי דם אדומים (RBC) lysis, להוסיף 1 מ”ל של 1 מאגר RBC lysis מאגר (לדלל 10x RBC מאגר lysis במים deionized), לערבב על ידי לאט pipetting למעלה ולרדת דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך. הכינו חרוזי פיצוי לכתמים בודדים. ל-1 מ”ל של מאגר FACS להוסיף 4 טיפות של כל חרוזים חיוביים ושליליים. מערבולת יסודית ולהוסיף 100 μL של פתרון חרוזים אחד 5 מ”ל FACS שפופרת. הכן 4 צינורות עם חרוזים ותווית כ-CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC ו- CD62P-PE. הוסף 1 מ”ל של מאגר FACS לכל שפופרת וצנטריפוגה ב- 287 x g למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והמשיכו על הקרח. לאחר lysis RBC, להוסיף 1 מ”ל של מאגר FACS לכל צינור ולשטוף כמתואר ב 12.7. זרוק את הסופרנטנט. הכן קוקטיילים נוגדנים: החלונית MPA: להוסיף 4 μL של CD45-APC, 4 μL של CD14-FITC ו 4 μL של CD41-BV421 כדי 388 μL של מאגר FACS. פאנל הרשות הפלסטינית: להוסיף 1.6 μL של CD41-BV421 ו 12 μL של CD62P-PE ל 386.4 μL של מאגר FACS. החלונית LI: להוסיף 4 μL של CD45-APC ו 8 μL של CD162-BV421 כדי 388 μL של מאגר FACS. שמור על קרח. הכן כתמים בודדים: הוסף 0.5 μL ל- 499.5 μL של מאגר FACS כל אחד עבור CD14-FITC, CD41-BV421 ו- CD45-APC. עבור CD62P-PE להוסיף 0.3 μL ל 499.7 μL של מאגר FACS. שמור על קרח. הכן פקדי FMO: (i) החלונית MPA (FMO-CD41): הוסף נוגדן 1 μL CD14-FITC ו μL אחד של CD45-APC נוגדן למאגר FACS 98 μL. (ii) החלונית PA (FMO-CD62P): הוסף 0.4 μL של CD41-BV421 ל- 99.6 μL של מאגר FACS. (iii) החלונית LI (FMO-CD162): הוסף μL אחד של CD45-APC ל- 99 μL של מאגר FACS. שמור על בקרות FMO על קרח. קוקטיילים נוגדנים מערבולת ולהוסיף 100 μL של כל קוקטייל נוגדן כפי שהוכן ב 12.12 לכל אחד מהצינורות המסויגים בהתאמה (MPA, הרשות הפלסטינית ולוח LI) כמתואר 12.3 ולערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. תמשיך לעבוד על RT בחושך. מערבולת נוגדני כתם יחיד ולהוסיף 100 μL של דילול נוגדני כתם יחיד כפי שהוכן ב 12.13. לכל אחד מהצינורות המסוממים בהתאמה עם חרוזים כמתואר ב- 12.7 ומערבבים בעדינות על-ידי התזת למעלה ולמטה. תמשיך לעבוד על RT בחושך. קוקטיילים נוגדנים FMO מערבולת ולהוסיף 100 μL של כל קוקטייל נוגדן FMO-1 כפי שהוכן ב 12.14. לכל אחד מהצינורות המסויגים בהתאמה (פקדי FMO) כמתואר ב- 12.5. ומערבבים בעדינות על ידי התפתלות למעלה למטה. שמור על RT בחושך. דגירה כל הצינורות עם כתמים נוגדנים במשך 30 דקות ב RT בחושך. קח את שלושת הצינורות עבור שליטה לא מוכתמת (ראה 12.4) וגלולה resspend ב 250 μL של מאגר FACS. שמור על קרח. לאחר זמן הדגירה, שטפו את כל הצינורות למעט פקדים לא מוכתמים פעם אחת עם מאגר FACS כמתואר ב- 12.7. גלולת תולה מחדש ב 250 μL של מאגר FACS ולרכוש נתונים על ציטומטר זרימה. השתמש בתאים לא מוכתמים עבור הגדרות שליליות וחרוזי עכבר פיצוי עבור הגדרות חיוביות בתוכנה FACS. יתר על כן, השתמש FMO כדי לשלוט באסטרטגיית gating, שבו FMO-CD41 משמש בחלונית MPA, FMO-CD62P משמש בחלונית הרשות הפלסטינית FMO-CD162 משמש בחלונית LI. לרכוש כמעט 0.5 x 106 – 0.25 x 106 אירועים לכל שפופרת עבור FACS. שמור נתונים ונתח באמצעות תוכנת ניתוח (גירסה 9.9.6).