Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.
Birçok kanser, onkojenik füzyon transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile sonuçlanan kromozomal translokasyonlarla karakterizedir. Tipik olarak, bu proteinler başka bir proteinin DNA bağlayıcı etki alanı (DBD) ile kaynaşmış özünde düzensiz bir etki alanı (IDD) içerir ve maligniteyi teşvik etmek için yaygın transkripsiyonel değişiklikler düzenler. Bu füzyonlar genellikle neden oldukları kanserlerde tekrarlayan tek genomik sapmadır ve bu da onları çekici terapötik hedefler haline getirir. Bununla birlikte, onkojenik transkripsiyon faktörlerini hedeflemek, düşük karmaşıklıktaki, IDD’lerin işlevlerinde oynadığı mekanistik rolün daha iyi anlaşılmasını gerektirir. EWSR1’in N-terminal etki alanı, EWS/FLI, EWS/ATF ve EWS/WT1 dahil olmak üzere çeşitli onkojenik füzyon transkripsiyon faktörlerinde yer alan bir IDD’dir. Burada, Ewing sarkomunda EWS/FLI’nin transkripsiyonel işlevi için önemli olan EWS alanının yapısal özelliklerini araştırmak için RNA dizilimini kullanıyoruz. Ewing sarkom hücrelerinden gelen endojen füzyonun ilk shRNA aracılı tükenmesi, çeşitli EWS-mutant yapılarının ektopik ekspresyonu ile eşleştirilmiştir. Daha sonra RNA dizilimi, EWS etki alanındaki mutasyonlarla ilişkili fonksiyonel açıkları karakterize etmek için bu yapıları ifade eden hücrelerin transkriptomlarını analiz etmek için kullanılır. Transkriptomik analizleri EWS/FLI DNA bağlama motifleri ve genomik lokalizasyon hakkında daha önce yayınlanan bilgilerle ve dönüşüm yeteneği için fonksiyonel testlerle entegre ederek, EWS/FLI’nin onkogenez için önemli yapısal özelliklerini belirleyebildik ve Ewing sarkomu için kritik öneme sahip yeni bir EWS/FLI hedef gen seti tanımlayabildik. Bu makale, onkojenik transkripsiyon faktörlerinin özünde düzensiz olan etki alanının yapı-işlev ilişkisini haritalamak için bir yöntem olarak RNA diziliminin kullanımını göstermektedir.
Çocukluk ve ergenlik birçok malignitesi de dahil olmak üzere kanserlerin bir alt kümesi, yeni füzyon onkogenleri 1 , 2 ,3,4,5,6oluşturan kromozomal translokasyonlarla karakterizedir. Elde eden füzyon proteinleri sıklıkla onkojenik transkripsiyon faktörleri olarak işlev görür ve tümöregenez7,8’iteşvik etmek için transkripsiyonel düzenlemede yaygın değişiklikler düzenler. Bu translokasyonlara sahip kanserler genellikle patognomonik füzyon4,9dışında az sayıda tekrarlayan genomik sapma ile sessiz bir mutasyonel manzaraya sahiptir. Bu nedenle, füzyon proteinini doğrudan hedeflemek bu hastalıklarda çekici bir terapötik stratejidir. Bununla birlikte, bu onkojenik transkripsiyon faktörleri genellikle DNA bağlayıcı bir etki alanı (DBD)10 , 11 , 12 , 13,14ile kaynaşmış düşük karmaşıklıklı, özünde düzensiz, transkripsiyonsal olarak aktive edici bir etki alanından oluşur. Bu proteinlerin hem özünde düzensiz etki alanları (IDD’ler) hem de DBD’leri geleneksel farmakolojik yaklaşımlarla hedef almakta zorlanmıştır. Bu nedenle, yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi, gen ekspresyonunu sapkın bir şekilde düzenlemek için bu füzyonların kullandığı mekanizmaların daha ayrıntılı bir moleküler anlayışını gerektirir.
EWSR1’in N-terminal IDD kısmı, Ewing sarkomunda EWS / FLI, dağınık küçük yuvarlak hücreli tümörde EWS / WT1 ve yumuşak parçaların açık hücre sarkomunda EWS / ATF1 dahil olmak üzere kanserde bir DBD ilekaynaşmıştır. Bu füzyonların her birinde EWS IDD’nin mekanistik rolü tam olarak anlaşılmaktadır. EWS/ETS füzyon ailesi, özellikle EWS/FLI, bugüne kadar işlevsel olarak en çok karakterize edilen ailedir. EWS/FLI, binlerce genin aktivasyonuna ve baskısına yol açan genom çapındaki epigenetik ve transkripsiyonel değişiklikleri koordine eder7,11,15,16. Çalışmalar, IDD’nin hem transkripsiyonal ko-aktivatörlerin (p300, WDR5 ve BAF kompleksi gibi) hem de yardımcı baskılayıcıların (NuRD kompleksi gibi)11 , 15,17. EWS IDD’nin FLI1’in C-terminal kısmına füzyonu, FLI1’in ETS DBD’sine yeni DNA bağlayıcı özgüllük kazandırır, böylece füzyon onkoprotein (EWS / FLI), konsensüs ETS motifi18 , 19,20’yeek olarak genomun tekrarlayan GGAA-mikrosatellit bölgelerine bağlanır. Yardımcı aktivatör işe alım fonksiyonu ile birlikte, EWS/FLI’nin bu acil DNA bağlama aktivitesi, GGAA-microsatellites distal to transkripsiyon başlangıç sahalarında (TSS) (“arttırıcı benzeri” mikrosatellitler) de novo arttırıcı oluşumunu teşvik eder ve işe alımlar GGAA-microsatellites proksimal ila TSS (“promotör benzeri” mikrosatellitler)11 , 15,16,21’detranskripsiyonu teşvik etmek için RNA polimeraz II.
Birlikte ele alındığında, bu veriler, EWS etki alanındaki ayrık unsurların farklı EWS / FLI bağlama sitelerine farklı yardımcı düzenleyicilerin işe alınmasına katkıda bulunduğu varsayımına yol açtı. Bununla birlikte, bu unsurların EWS/FLI’nin EWS bölümünde ayırt etmek ve nasıl çalıştıkları, etki alanının son derece tekrarlayan ve düzensiz doğası tarafından engellenmiştir. Burada, EWS IDD’deki bu elementleri işlevsel olarak haritalamak için Ewing sarkom hücrelerinde daha önce yayınlanan bir nakavt kurtarma sistemini kullanıyoruz. Bu sistemde EWS/FLI, FLI1 geninin 3’UTR’sını hedefleyen bir shRNA kullanılarak tükeniyor ve ifade, 3’UTR 7,17, 22’denyoksun değişen EWS/FLI mutant cDNA yapıları ile kurtarılıyor. Bu deneyler, GGAA-mikrosatellit muhabir yapısının aktivasyonu, koloni oluşumu tahlilleri ve EWS/FLI tarafından aktive edilen ve bastırılmış genlerin7,17,22 gibi önemli onkojenik fenotipler arasındaki yapı-işlev ilişkisini haritalamak için çeşitli silmelere sahip yapılara odaklanmıştır. . Ancak, bu çalışmalar EWS/FLI’deki EWS IDD’de etkinleştirme veya baskı için benzersiz olarak önemli olan ayrık alt etki alanları bulamadı. Test edilen tüm yapılar, belirli hedef genleri hem aktive edebildi hem de bastırabildi, verimli koloni oluşumuna yol açtı veya EWS / FLI hedef genlerinin hiçbirini düzenleyemedi, koloni oluşumunun kaybına yol açtı7,17,22.
Yeni nesil dizilemenin yaygın olarak benimsenmesinin sağladığı transkriptomik analizler, gen ekspresyon imzalarını tarama veya açıklayıcı çalışmalar bağlamında iki koşulda karşılaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun yerine, IDD’lerin transkripsiyon faktörü işlevine katkılarını karakterize etmek için RNA dizilimini (RNA-seq) kullanarak genom çapında ifade verilerini yakalama yeteneğinden yararlanmak istedik. Bu durumda RNA-seq, EWS etki alanının yapı işlevi ilişkisini keşfetmek için devirme-kurtarma sistemiyle eşleştirilir. Bu yaklaşım, diğer EWS füzyonları veya iyi anlaşılamayan işleve sahip wildtype transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer füzyon transkripsiyon faktörleri için geçerlidir ve muhabir tahlilleri veya hedeflenen qRT-PCR gibi fonksiyonel haritalama çalışmaları için kullanılan diğer testlere göre birden fazla avantaja sahiptir. Bunlar arasında fonksiyonun yapısal belirleyicilerinin ilgili kromatin bağlamında test edilmesi, birden fazla yanıt elemanının bir testte test edilebilmesi (örneğin, etkinleştirilmiş ve bastırılmış, GGAA-mikrosatellit ve mikrosatellit olmayan vb.) ve ortaya çıkan kısmi işlevi daha iyi tespit etme yeteneği sayılmalıdır.
Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde uygulanması, ilgi fenotiplerini yakalayan hücre tabanlı bir sisteme (bu durumda shRNA aracılı EWS/FLI tükenmesine sahip A673 hücreleri) ve hücre tabanlı sisteme uygun bir ifade vektöründeki mutant yapılar paneline bağlıdır (bu durumda, retroviral transdüksiyon ile teslim edilecek çeşitli 3x BAYRAK etiketli EWS/FLI mutantları ile pMSCV-hygro). CRISPR tabanlı tükenme yapılarının, shRNA tabanlı tükenme yapılarının ve kararlı hücre çizgileri oluşturmak için uygun seçime sahip cDNA ifade yapılarının viral transdüksiyonunun geçici transeksiyon üzerinden yapılması önerilir. Transkriptomik veriler, transkripsiyon faktörünün yerelleştirilmesi ve mevcut olan diğer fenotipik okumalarla ilgili diğer verilerle eşleştirilebildiğinde sonuçların aşağı yönlü yorumu güçlenir.
Bu yazıda, EWS / FLI14’ünDAF mutantının aktivitesini karakterize etmek için bu yaklaşımı uyguluyoruz. DAF mutant, EWS/FLI 14’ün EWS IDD’nin tekrarlayan bölgelerinde alanin mutasyonlarına17tirozin içerir. Bu özel EWS mutant daha önce rapor edilmişti ve ATF1 DBD14ile kaynaştığında muhabir gen ekspresyonını etkinleştiremiyor. Bununla birlikte, ön qRT-PCR verileri, bu mutantın EWS / FLI hedefinin transkripsiyonunu etkinleştirebildiğini öne sürdü NR0B123. Burada açıklanan transkriptomik yaklaşım, DAF mutantının kısmi işlevinin başarılı bir şekilde algılanmasını sağladı. Bu transkriptomik verileri EWS/FLI bağlama ve tanıma motifleri hakkındaki bilgilerle eşleştirerek, DAF mutantın GGAA-mikrosatellite tekrarlarında işlevini koruduğunu daha da gösteriyoruz. Bu sonuçlar DAF’ı ilk kısmen işlevsel EWS/FLI mutant olarak tanımlar ve onkogenez için önemli olan mikrosatellit olmayan genlerdeki işlevi vurgular (bildirildiği gibi23). Bu, onkojenik transkripsiyon faktörlerinin işlevi hakkında fikir vermek için bu transkriptomik yapı fonksiyonu haritalama yaklaşımının gücünü göstermektedir.
Onkojenik transkripsiyon faktörlerinin biyokimyasal mekanizmalarının incelenmesi, neden oldukları hastalıkları anlamak ve yeni terapötik stratejiler tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu özellikle füzyon transkripsiyon faktörleri ile sonuçlanan kromozomal translokasyonlarla karakterize malignitelerde geçerlidir. Bu kimerik proteinlere dahil edilen etki alanları, vahşi tip proteinlerde bulunan düzenleyici alan adlarıyla anlamlı etkileşimlerden yoksun olabilir ve füzyon bağlamında yapı işlev bilgilerini yorumlama yeteneğini zorlaştırabilir26,27,28. Ayrıca, bu onkojenik füzyonların çoğu, özünde düzensiz alan adları10 , 13,29,30.
EWS etki alanı, çeşitli onkojenik füzyonlarda yer alan bu tür özünde düzensiz bir etki alanı örneğidir10. Özünde düzensiz ve tekrarlayan doğa, EWS etki alanı tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları anlama çabalarını engellemıştır. Yapı işlevini araştırmak için önceki çabalar büyük ölçüde muhabir gen tahlilleri bağlamında veya ilgili hücresel bağlamı yeniden yakalayamayan veya anlamlı kısmi işlev 11,17,25üreten herhangi bir yapısal varyasyondan yoksun hücre arka planlarında farklı mutantlar kullanmaya başvurmuşlardır. Burada sunulan yöntem bu sorunları gidermektedir. Yapı fonksiyonu eşlemesi hastalıkla ilgili bir hücre bağlamında gerçekleştirilir ve yeni nesil sıralama, transkripsiyon faktörü işlevini yerel kromatin ayarında değerlendirmek için transkriptomik profil oluşturmayı sağlar. EWS / FLI’nin DAF mutantının özel durumunda, DAF’ın izole yanıt öğeleri kullanarak muhabir testlerinde çok az aktivite gösterdiği, ancak tam gen promotörü bağlamında, bir muhabir testinde veya yerel kromatin bağlamında aktivite gösterdiği bildirildi, ilginç bir fenotip23. Burada açıklanan yöntemin daha doğrudan kullanılması, genom genelinde hangi tür düzenleyici elementlerin hastalık ortamında en duyarlı olduğu sorusunu doğrudan çözmektedir. Tüm aday hedef genleri kendi doğal kromatin bağlamlarında aynı anda test ederek, transkriptomik bir yaklaşımın kısmi işleve sahip yapıları tanımlama olasılığı daha yüksektir.
Hastalıkla ilgili bir hücre arka planı kullanmanın doğal gücü, bu tekniğin belki de en büyük sınırlamasıdır. En önemli faktörlerden biri bu deneyler için uygun hücre sistemini seçmektir. Patognomonik transkripsiyon faktörlerine sahip malignitelerden elde edilen birçok hücre hattı, bu transkripsiyon faktörünün devrilmesini kolayca tolere etmez ve birçok durumda, özellikle pediatrik kanserler için, gerçek orijin hücresi tartışmalı olmaya devam eder ve onkogenin diğer hücre arka planlarındaki ifadesi yasaklayıcı derecede toksiktir31,32 . Bu durumlarda, araştırmacı sonuçların yorumlanmasında dikkatli olduğu ve daha hastalıkla ilgili bir hücre tipinde ilgili bulguları uygun şekilde doğrulediği sürece, farklı bir hücre arka planında deneyler yapmak yararlı olabilir.
Onkogen ekspresyonunun stabilitesini ve fenotipik sonuçlarını dikkatlice doğrulamak ve yalnızca katı kriterleri karşılayan sıralama için örnekler göndermek kritik öneme sahiptir. Burada, bu, nakavt ve kurtarmayı onaylamak için batı lekesini ve pozitif kontrolü doğrulamak için az sayıda bilinen hedef genin qRT-PCR’ını içeriyordu (Şekil 2). Aynı şekilde, hücre ve RNA preparatlarını her parti boyunca mümkün olduğunca benzer şekilde gerçekleştirerek mümkün olduğunca fazla parti değişkenliğini azaltmak çok önemlidir.
Burada açıklanan yöntem, çalışma altındaki transkripsiyon faktörünün genom çapındaki işlevine hitap eden diğer genomik veri türleriyle eşleştirildiğinde özellikle güçlü hale gelir. Bu tür yapı-işlev analizi için gelecekteki yönler, transkripsiyon faktörünün bağlanmasını ve kromatin erişilebilirliğindeki herhangi bir indüklenen değişiklikleri belirlemek için ChIP-seq ve ATAC-seq’i içerecek şekilde genişleyecektir. Bir paket olarak, bu tür veriler, onkojenik transkripsiyon faktörünün farklı yapısal bileşenlerinin işlevin farklı yönlerine katkıda bulunduğu yere işaret edebilir (örneğin DNA bağlama ve kromatin modifikasyonu ve yardımcı düzenleyici işe alımı). Genel olarak, füzyon transkripsiyon faktörlerinin yapı-fonksiyon ilişkilerini haritalamak için NGS tabanlı yaklaşımların kullanılması, bu proteinlerin onkojenik işlevinin biyokimyasal belirleyicileri hakkında yeni içgörüler ortaya çıkarabilir. Bu, neden oldukları hastalıkları daha iyi anlamamız ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini sağlamak için önemlidir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü’ndeki Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Tesisi tarafından desteklendi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü [U54 CA231641 to SLL, R01 CA183776 to SLL] tarafından desteklendi; Alex’in Limonata Standı Vakfı [ERT’ye Genç Araştırmacı Ödülü]; Pelotonia [ERT Bursu]; ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi CJ Martin Yurtdışı Biyomedikal Bursu [APP1111032’den Kİp’e].
Wet Lab Reagents | |||
anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
Cryotubes | For viral aliquots | ||
DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
HEPES | Gibco | 15630106 | |
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
Software | |||
Access to HPC environment | |||
AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
Cairo | 1.5-10 | ||
DESeq2 | 1.16.1 | ||
genefilter | 1.58.1 | ||
ggbiplot | 0.55 | ||
ggplot2 | 3.1.1 | ||
org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
pheatmap | 1.0.12 | ||
PuTTY | |||
R | 3.4.0 | ||
RColorBrewer | 1.1-2 | ||
reshape2 | 1.4.3 | ||
rgl | 0.100.19 | ||
R-studio | |||
STAR | Version 2.6 or later | ||
sva | 3.24.4 | ||
TrimGalore! | |||
WinSCP |