トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

1. 構成体のインビトロパネルを設定する 注:このステップは、分析する特定のタンパク質によって異なります。 必要に応じて、ウイルスのアリコートを枯渇や発現構造に備える。 ウイルス導入に必要な各構築物に対して、3-5 x 106 HEK293-EBNAまたはHEK293T細胞を使用して10cmの組織培養皿をシードします。10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(P/S/Q)、0.3 mg/mL G418を補ったダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)で細胞を一晩接着させます。注:HEK293-EBNAおよびHEK293T細胞は、増殖が容易で、トランスフェクション効率が高く、エピソームプラスミドから組み換えタンパク質を効率的に発現するため、ウイルス産生に推奨されています。細胞は、トランスフェクションの日に50〜70%コンフルエントの間でなければなりません。 各ウイルス導入構築物のためのトランスフェクションミックスを準備します。2 mLの減らされた血清培地と90 μLのトランスフェクション試薬を組み合わせます。注意:予め温めの低下した血清培地を推奨します。 ウイルス包装プラスミド(例えば、gag-pol)、ウイルスエンベローププラスミド(例えば、VSV-G)、CRISPRベースの枯渇、shRNAベースの枯渇、またはcDNA発現構造(例えば、pMKOまたはpMSCV)のいずれかをトランスフェクションミックスにそれぞれ10μg添加する。穏やかなピペットでよく混ぜます。 トランスフェクションミックスを室温で20分間座らせます。組織培養皿からHEK293-EBNA成長培地を取り除き、10S、P/ S/Q、および10 mMナトリウムピルビン酸を添加した3mL DMEMを加えます。各料理に、2 mLのトランスフェクションミックスを滴下して加えます。細胞は、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターで一晩トランスフェクション培地に座らせます。 翌朝、10S、P/S/Q補充、および10 mMナトリウムピルビン酸を含むDMEM培地を20 mL追加します。細胞を37°Cで、5%CO2で一晩インキュベートします。 翌朝、メディアを5mLウイルス収集メディア(VCM)に交換します(DMEMは10%の熱不活化FBS、P / S / Q、および20 mM HEPESで補います)。 4時間後、プレートからVCMを収集し、4°Cの氷上の50 mL円錐管に保管してください。 5 mLの新鮮なVCMに交換してください。 4時間後、同じ50 mL円錐形チューブのプレートからVCMを収集し、4°Cで氷の上に保管してください。 一晩のコレクションのための新鮮なVCMの8 mLと交換してください。 朝はプレートからVCMを収集し、4°Cの氷の上に50 mL円錐管に保管してください。 5 mLの新鮮なVCMに交換してください。 4時間後、プレートからVCMを収集し、4°Cの氷の上に50 mL円錐管に保管してください。 5 mLの新鮮なVCMに交換してください。4時間後、プレートからVCMを収集し、50 mL円錐管に追加します。 0.45 μm フィルターを濾過した後、50 mL チューブからクライオチューブ (アリコートあたり 2 mL) までのアリコート コレクション。使用するまで-80°Cでウイルスアリコートを保管してください。注: プロトコルはここで一時停止することができ、ウイルスのアリコートは使用できるまで保存できます。 10cmの組織培養皿において適切な密度で細胞をシードする。目標50%合流。細胞は、5%CO2を含む37°Cでインキュベーターに入れることによって一晩接着させる。注:A673細胞の場合、これは10S、P / S / Q補充、および10 mMナトリウムピルビン酸を有するDMEM培地の10 mLで5 x 106 細胞です。これらの条件は、使用する細胞の増殖速度によって異なる場合がある。 関心のある内因性の要因を枯渇.細胞が目的の内因性タンパク質を枯渇させる必要がない場合は、ステップ1.4に進んでください。 目的のタンパク質を標的とするshRNAまたはCRISPR構築物の伝達のためのウイルスアリコートを解凍する。37°Cの水浴で冷凍アリコートを素早く解凍します。 各ウイルスアリコートに8mg/mLポリブレンの2.5 μLを加え、穏やかなピペットで混ぜます。細胞のプレートから培地を取り除き、プレートの側面に沿ってピペッティングして10cmプレートにウイルスアリコートを静かに加えます。プレートを揺らし、2 mLのウイルスアリコートを広げる。 組織培養インキュベーター中で37°Cで2時間インキュベートする。プレートの領域が乾燥するのを防ぐために、30分ごとにプレートを揺らします。 5 mLのDMEM培地に10S、P/S/Q補充、10 mMのピルビン酸ナトリウムを加え、5 μLの8 mg/mLポリブレンを加えます。細胞を一晩インキュベートしましょう。 朝、細胞から培地を取り出し、細胞を通過させると、選択試薬を補充した培地に入れ替わります。細胞を通過させる場合は、48-72時間成長し、50%の合流に達するようにそれらを播種します。注:pSRP-iEF-2のA673細胞の場合、細胞は1:5分割で播種され、2μg/mLピューロマイシンで72時間選択されます。 cDNA 発現構造を変換します。 50~70%の合流性を確認するために細胞を確認してください。 対象のcDNAコンストラクトの伝達のためのウイルスアリコート(複数可)を解凍する。37°Cの水浴で冷凍アリコートを素早く解凍します。各ウイルスアリコートに8mg/mLポリブレンの2.5 μLを加え、穏やかにピペットで混ぜます。 メッキされた細胞から培地を取り出し、プレートの側面に沿ってピペット処理を行い、10cmプレートにウイルスアリコートを加えます。プレートを揺らし、2 mLのウイルスアリコートを広げる。 組織培養インキュベーター中で37°Cで2時間インキュベートする。プレートの領域が乾燥するのを防ぐために、30分ごとにプレートを揺らします。 5 mLのDMEM培地に10S、P/S/Q補充、10 mMのピルビン酸ナトリウムを加え、5 μLの8 mg/mLポリブレンを加えます。細胞を一晩インキュベートしましょう。 朝、細胞から培地を取り出し、セルを通過させるセルを二重選択媒体にします。cDNAコンストラクトの二重選択と発現を可能にするために、必要に応じて細胞を成長させ、7〜10日間通過させます。注: この節の分割では、異なるセルラインの最適化が必要になる場合があります。pSRP-iEF-2とpMSCV-ハイグロコンストラクトを有するA673細胞の場合、細胞は2μg/mLピューロマイシンおよび100 μg/mLハイグロマイシンに分かれずに渡されます。 2. 細胞を収集し、構成体の発現を検証し、相関表現法アッセイを設定する 二重選択の7-10日後に15 mL円錐管の細胞を集める。集めた細胞をヘモサイトメーターで数える。アリコートは、RNA-シーケンシング用の細胞を収集し、cDNA構築物の発現を検証した。注:調査中の研究課題に必要な相関表現型アッセイを設定してください。コロニー形成アッセイは、ここで使用される相関表現型アッセイの一例である。 5 x 105と 1 x 106細胞の間で RNA-シーケンシング、2 x 106細胞を収集してタンパク質抽出を行います。ペレット細胞は、4°Cで1,000xgで5分間遠心分離し、上清を除去した。 1 mL の冷たい PBS でペレットを洗います。4°Cで1,000xgで5分間遠心分離して5分間ペレットを除去し、上清を除去します。フラッシュは液体窒素中のペレットを凍結し、-80°Cで保存します。 残りのセルに対して、任意の相関アッセイを設定します。注: このプロトコルは、収集したサンプルを -80 °C の冷凍庫に保存して、ここで一時停止できます。 目的のタンパク質のノックダウン(使用する場合)と構築物のパネルの発現を検証します。 氷上でのタンパク質抽出用の細胞ペレットを解凍します。氷冷500μL核抽出バッファー(20 mM HEPES pH 7.9,140 mM NaCl,10%グリセロール,1.5 mM MgCl2,1mM EDTA,1 mM DTT,1%IGEPAL)を用いた細胞を再懸濁液化します。氷の上に5分間座らせます。 ペレット核は、4°Cで1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を除去した。500 μL 氷冷核抽出バッファー (20 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 10% グリセロール, 1.5 mM MgCl2,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% IGEPAL) の核をプロテアーゼ阻害剤で洗浄します。 ペレット核は、4°Cで1,000 x g で5分間遠心分離して上清を除去します。プロテアーゼ阻害剤を用いて200μLの冷たいRIPAバッファーで核を再懸濁する(ペレットサイズに応じてRIPAバッファの体積を調整する)。15分ごとに激しい渦を出して45〜60分間氷の上に座らせます。 45〜60分間4°Cで16,000 x g の遠心分離によるペレット細胞デブリ。上清を保ち、新鮮な冷たい管に移す 5分間の1x負荷バッファーで5~10 μgのタンパク質を沸騰させることにより、SDS-PAGE電気泳動用サンプルを調製します。目的のタンパク質に必要な SDS-PAGE ゲルを実行します。 目的のタンパク質に必要に応じてニトロセルロースまたはPVDF膜に移します。ブロック、および適切な一次および二次抗体を用いてブロットして、内因性タンパク質のノックダウン(使用する場合)およびcDNA構築物の異所発現を確認する。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 RNAを抽出します。RNAの品質と量を評価します。 氷の上に細胞ペレットを解凍します。メーカーの指示に従ってシリカスピンカラムベースの抽出キットを使用して、トータルRNAを抽出します。 簡単に言えば、キットのライシスバッファーを使用して細胞をライスします。30〜60秒間>13000 rpmで短いスピンでシリカスピンカラムにライセートを塗布するか、または30〜60秒間>13000rpmで短いスピンでgDNA除去カラムにライセートを適用してgDNAを除去します。 シリカスピンカラムに直接リセートを適用した場合は、オンカラムDNA消化を行います。gDNA除去カラムを使用する場合は、30〜60の>13000rpmで短いスピンでシリカスピンカラムに溶出物を塗布します。 メーカーの指示に従ってカラムにRNAを洗浄します。溶出バッファーの 30 μL で RNA を溶出します。 フルオロメーター、または他の同等の機器を使用して、RNAの品質と量を評価します。260/280比が2に近く、シーケンシング用に2.5μg以上のRNAが存在することを確認してください。注: レプリケートが収集されると、各複製は同じ RNA 抽出プロトコルで処理する必要があります。 必要に応じて、qRT-PCR によって目的のタンパク質の安定したノックダウンを確認するために、RNA の小さなアリコートを使用します。残りのRNAサンプルは-80°Cで保存してください。 3~4個の完全なRNAセットが収集されるまで、ステップ1~2を繰り返して生物学的複製物を収集します。各複製が、cDNA構築物の適切な発現と内因性タンパク質の安定したノックダウン(使用する場合)を表示することを確認します。 3. 次世代シーケンシング 5,000万個の150塩基対(bp)ペアエンドリードを目標とする次世代シーケンシングプラットフォームを使用して、抽出されたRNAをシーケンシングします。サンプルを処理する施設の指示に従います。ポリアデニル化 RNA とストランド固有のシーケンシングを選択します。 4. アライメントとトランスクリプトカウントパイプライン 注: このプロトコルは、次のサンプルの送信と処理を、各サンプルに対して一連の FASTQ ファイルが返されることを前提としています。これらのファイルは、頻繁に “fastq.gz という接尾辞を付けて圧縮されます。これらのFASTQファイルのさらなる分析は、Linuxオペレーティングシステムを実行しているハイパフォーマンスコンピューティング(HPC)機能へのアクセスを必要とします。 ファイルの転送 PuTTY で HPC 環境に端末を開きます。「プロジェクト」と呼ばれる分析のためのディレクトリを作成します。 「path_to/プロジェクト」ディレクトリに移動し、”fastq”と呼ばれる圧縮された raw fastq.gz ファイルの新しいディレクトリを作成します。また、「トリミング」というディレクトリを作ります。これは 図 S1A-Cに示されています。 WinSCP または同様のプログラムを使用して、ローカルストレージから “path_to/project/fastq/” ディレクトリに圧縮された生の fastq.gz ファイルを転送します。 図 S1Bに示すように、各サンプルに “R1” と “R2” ファイルがあることを確認します。 オプション: 必要に応じて、TrimGalore をインストールします。Linux の PATH 環境変数で、trim_galore実行可能ファイルを含むディレクトリを設定します。メモ: 低品質の読み取りとアダプターは TrimGalore でトリミングされます。トリムガロアは https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore で入手できます。 オプション: ダウンロードしたソフトウェアパッケージのディレクトリに移動します (つまり、「path_to/ソフトウェア」)。コマンドを使用して最新のTrimGaloreパッケージをダウンロードします “curl -fsSL https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/[バージョン].tar.gz -o trim_galore-[バージョン].tar.gz。 オプション: tar .gz ファイルをアンパックします。コマンド “tar -xvzf trim_galore-[version_number].tar.gz”を使用します。 オプション: TrimGalore を実行可能にします。コマンドを使用して “chmod a +x path_to/ソフトウェア/トリムガロア-[バージョン]/trim_galore”.この新しいディレクトリが PATH に含まれるようにしてください。コマンドを使用して”PATH=path_to/ソフトウェア/トリムガロア-[バージョン]:$PATH”。 path_to/プロジェクト/ファストク/にナビゲートします。 図 S1Cに示すコマンドを使用して、fastq.gz ファイルからの低品質の読み取りをトリムするには TrimGalore を使用します。注 : このコマンドの追加フラグは関連している可能性があり、ここで見つけることができます: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/blob/master/Docs/Trim_Galore_User_Guide.md path_to/プロジェクト/トリミングされたディレクトリ内のトリミングされた fastq.gz ファイルを確認します。sample1_R1_val_1.fq.gzとsample1_R2_val_2.fqと呼ばれることを確認してください.gz トリムされた FASTQ ファイルを STAR に合わせて、トランスクリプトの数を生成します。注:星は https://github.com/alexdobin/STAR)で入手可能です。 オプション: STAR バージョン 2.6 以降をインストールします。パスに STAR 実行可能ファイルを設定します。 オプション: ダウンロードしたソフトウェアパッケージのディレクトリに移動します (つまり、「path_to/ソフトウェア」)。 オプション: コマンド 「curl -SLO https://github.com/alexdobin/STAR/archive/[バージョン].tar.gz」を使用して STAR パッケージをダウンロードします。tar .gz ファイルを解凍します。 オプション: コマンド 「tar -xzf [バージョン].tar.gz」を使用します。STAR を実行可能にします。コマンドを使用して “chmod a +x path_to/ソフトウェア/STAR-[バージョン]/ビン”. オプション: この新しいディレクトリーがパス内に存在することを確認します。コマンド「PATH=path_to/ソフトウェア/STAR-[version_number]/ビン/linux_x86_64_static:$PATHをエクスポートする」コマンドを使用してください。注意:STARマニュアルは次のページにあります: (https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf)。 STARで使用するゲノムインデックスがあることを確認します。これをpath_to/プロジェクト/ディレクトリとは別のディレクトリに配置します。以前の実験でインデックスが生成された場合は、それを使用します。代わりに、適切な事前生成インデックスを使用してください http://refgenomes.databio.org/。それ以外の場合は、STAR マニュアルの指示を使用して、”STAR–runMode genomeGenerate” コマンドを使用して新しいインデックスを構築します。注: このプロトコルの残りの部分では、STAR インデックスへのパスは「path_to/STAR_index」と呼ばれます。 path_to/プロジェクト/ディレクトリに移動します。 図 S1Dに示すように、”STAR_output” という新しいディレクトリを作成します。 path_to/プロジェクト/トリミング/ディレクトリに移動します。 図 S1D に示すコマンドを使用して STAR を実行し、トリミングされた fastq.gz ファイルを整列します。注: このステップは、計算負荷が最も高く、複数のスレッド (つまり、>16) がアライメントタスク用に指定された HPC クラスター上で実行することをお勧めします。サンプル数や利用可能な計算リソースによっては、この手順に数時間から数日かかる場合があります。 次の場所で、トランスクリプトごとの数を含む次のステップに必要な出力を見つけます: path_to/プロジェクト/STAR_output/sampleN_ReadsPerGene.out.tab。注: ReadsPerGene.out.tab ファイルの列 1 には、カウントされる機能に関する情報が保持されます。列 2 には、立ち往生していない読み取りカウントが保持され、列 3 は前方の立ち往生読み取りカウントを保持し、列 4 は逆の読み取りカウントを保持します。このファイルの最初の 4 行には、単一のジーンに合致しなかった位置合わせ読み取りに関する情報が含まれます。このプロトコルには、非孤立読み取りカウントが必要です。 HPC 環境で RStudio (推奨) または R を使用して、各サンプルの列 1 および 2 の行 5 および下のデータをコンパイルします。Rの「プロジェクト」に作業ディレクトリを設定します。 図 S2Aのコマンドを使用して、各 ReadsPerGene.out.tab ファイルを読み取ります。最初の列では、下流処理を容易にするために、「Ensembl遺伝子ID」列の「.」の前の文字のみを使用します。 図 S2Bのコマンドを使用して、すべてのサンプルから “totcts” というデータフレームにカウントをコンパイルします。この新しい未処理カウント データのテーブルを、必要に応じて “write.table” コマンドを使用して、.txtファイルで区切られたタブとして保存します sample_counts.txt。注: Ensembl 遺伝子 ID の順序は、サンプル間のすべての ReadsPerGene.out.tab ファイルで同じです。 5. 微分式と下流解析 ComBat を使用してサンプル間のバッチ効果を正規化します。注:遺伝子発現の変化を説明する2つの変数があり、最初は使用される構造(すなわちサンプル)であり、第2は時間の経過(すなわちバッチ)に関連する外部要因である。R パッケージ ComBat を使用してバッチからバッチへのバリエーションのサンプルを正規化する手順をお勧めします。 必要に応じてインストールし、sva、DESeq2、アノテーションDBI、組織のライブラリをロードします。Hs.例.db、プヒートマップ、RColorBrewer、遺伝子フィルター、カイロ、ggplot2、ggbiplot、rgl、および図 S2Cに示すように再形状2。インストールの場合は、各パッケージのドキュメントに従って”install.packages”コマンドまたはバイオコンダクタを使用してください。 最初に、読み取りごとに少なくとも 1 つのカウントを持つ遺伝子のみにデータをフィルター処理します。 図 S2Dに示すように、この新しいテーブルを保存して、フィルタリングを示します。注: 多くの遺伝子は読み取り数が非常に少ないか、まったく読み取り数を持たない場合があります。 図 S2Eに示すように、”vars” と呼ばれるバッチ正規化用の 2 つ目のテーブルを準備します。行名を各サンプルの一意の名前に設定します。列名を「サンプル」、「バッチ」、および「コンストラクト」に設定します。 すべてのサンプルに、1 ~ n の”サンプル”列に一意の数値を割り当て、n はサンプル数です。「バッチ」列のすべてのサンプルにロット番号を割り当て、条件a_1と条件b_1の両方が 1 に割り当てられ、条件a_2と条件b_2の両方が 2 に割り当てられます。条件-aのサンプルがすべて「A」であり、条件bサンプルがすべて「B」になるように、「コンストラクト」列のすべてのサンプルにすべての条件指定を割り当てます。 図 S2Fに示すように、バッチ変数と ComBat の特定の null モデル行列も定義します。図 S2Fで定義されたコマンドを使用して ComBat を実行します。 さらに、最も近い整数に丸めることでデータをキュレーションします。また、負の値を持つ遺伝子を削除します。 図 S3Aに示すコマンドを使用します。注: バッチ正規化の出力には、整数以外の読み取り数と負の値を持ついくつかの遺伝子が含まれます。下流の微分式解析では負の読み取り数がサポートされないため、この手順が必要です。 DESeq2 を使用して、各構成体の微分式プロファイルを定義します。 図 S3Bに示すように、DESeq2 の実験計画を入力します。DESeqDataSetFromMatrix 関数を使用して DESeqDataSet (dds) を構築し、サイズファクターを見積もり、DESEq2 を実行します (図 S3Bを参照)。注: 「条件」に入力された列データは、カウント行列の列と同じ順序にすることが不可欠です。 分析の品質を評価するために、DESeq2 で使用される rlog 正規化されたカウントを抽出します ( 図 S3Bを参照)。注: 分析中、DESeq2 は、サンプル間でカウントが大きい遺伝子の差を保持するために、サンプル数が少ない (情報が少ない) 遺伝子のサンプル間の違いを縮小する「正規化されたログ」、rlog、変換を行います(高い情報)。 DESeq2の結果から転写プロファイルごとに結果を抽出する場合、 図S3Cに示すように、ノックダウン条件またはベースライン空ベクトルのいずれかを参照して対方向比較を行う。 さらに、図S3Dに示すようにHGNC遺伝子シンボルを用いてこれらの結果を修正する。 図S3Eに示すように、DESeq2結果からデータを抽出します。log2FoldChangeと生および調整されたp値を持つすべてのコンストラクトのEnsembl遺伝子ID、HGNCシンボル、基本平均式、および微分発現データを含む単一のファイルとしてエクスポートします。注: 調整された p 値< 0.05 を使用すると、微分式のカットオフを推奨します。 バッチ正規化の成功とサンプル内の類似性を評価します。 図 S4A-Bに示すコードを使用して、rlog 正規化カウントを使用して、PCA とサンプルからサンプルまでの距離プロットを使用してサンプル・クラスタリングをチェックします。 微分式プロファイルを使用して、 図 S4C のコードを使用して火山プロットを生成します。構成体間の遺伝子発現の変化を評価する。 rlog 正規化カウントと階層クラスタリングを使用して、異なる構成要素に固有の遺伝子シグネチャを識別します。 図 S4Dに示すコードを使用します。 マトリックス内のすべてのコンストラクトで、最も多くの可変遺伝子を抽出します。pheatmap を使用して、これらの遺伝子に基づいてサンプルの教師なし階層クラスターを実行します。 目的の樹状図クラスターの表示レベルを決定して、デデンドログラムから目的のクラスターを抽出します。”k” をそのレベルのクラスターの数に設定します。 図 S5に示すように、クラスターによって順序付けられたヒートマップを再プロットして、どのクラスターが対象であるかを判断します。 表 S1に示すように、各クラスターに関連付けられた遺伝子のリストをエクスポートします。この情報を使用して、対象となるクラスター内の遺伝子を判別します。 同定された遺伝子の異なるクラスターの生物学的役割を特定し、クラス間で比較します。これは、バイオインフォマティクスの様々なツールを使用して行うことができます。ToppGene24 はここで使用され、オンラインで自由に利用できます。注:ウェブサイト上のフィールドにコピーして貼り付けるために遺伝子のリストを必要とする多くの無料ツールがあります。調査中の研究課題に最適な分析ツールを選択します。 必要に応じて、目的の転写因子の転写出力を駆動するゲノム結合に関するデータがある場合、異なる結合要素に関連する遺伝子における転写応答を比較して、変異関数をさらに評価する。 6. 関連する型との比較 相関表現型と生成されたトランスクリプトームプロファイルデータを比較し、適切に解釈します。