JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Published: June 27, 2020
doi:
10.3791/61564
, , , , ,
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases,Abigail Wexner Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program,The Ohio State University, 3Division of Pediatric Hematology/Oncology/Blood & Marrow Transplant,The Ohio State University, 4Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

תחומים עם הפרעה מהותית חשובים לתפקוד גורם שעתוק היתוך אונקוגני. כדי למקד חלבונים אלה באופן טיפולי, נדרשת הבנה מפורטת יותר של מנגנוני הרגולציה המועסקים על ידי תחומים אלה. כאן, אנו משתמשים בתעתיק כדי למפות תכונות מבניות חשובות של תחום EWS שהופרע באופן מהותי בסרקומה יואינג.

Abstract

סוגי סרטן רבים מאופיינים בהעברות כרומוזומליות אשר גורמות לביטוי של גורמי שעתוק היתוך אונקוגניים. בדרך כלל, חלבונים אלה מכילים תחום מהותי (IDD) התמזג עם תחום מחייב DNA (DBD) של חלבון אחר ולתזמר שינויים תמלול נרחבים כדי לקדם ממאירות. היתוך אלה הם לעתים קרובות הסטייה הגנומית החוזרת היחידה בסרטן שהם גורמים, מה שהופך אותם למטרות טיפוליות אטרקטיביות. עם זאת, מיקוד גורמי שעתוק oncogenic דורש הבנה טובה יותר של התפקיד המכניסטי כי מורכבות נמוכה, IDDs לשחק בתפקידם. תחום N-terminal של EWSR1 הוא IDD המעורב במגוון גורמי שעתוק היתוך אונקוגניים, כולל EWS / FLI, EWS / ATF, ו- EWS / WT1. כאן, אנו משתמשים ברצף RNA כדי לחקור את התכונות המבניות של תחום EWS החשובות לתפקוד תמלול של EWS / FLI בסרקומה יואינג. תיווך שרנ”א ראשון של ההיתוך האנדוגני מתאי סרקומה יואינג בשילוב עם ביטוי חוץ רחמי של מגוון מבנים מוטנטיים EWS מבוצע. לאחר מכן רצף RNA משמש לניתוח התמלולים של תאים המבטאים מבנים אלה כדי לאפיין את הגירעונות התפקודיים הקשורים מוטציות בתחום EWS. על ידי שילוב הניתוחים התמלוליים עם מידע שפורסם בעבר על מוטיבים מחייבים DNA EWS / FLI, ולוקליזציה גנומית, כמו גם בדיקות פונקציונליות לשינוי היכולת, הצלחנו לזהות תכונות מבניות של EWS / FLI חשוב עבור oncogenesis ולהגדיר קבוצה חדשה של גנים היעד EWS / FLI קריטי עבור סרקומה יואינג. מאמר זה מדגים את השימוש ברצף RNA כשיטה למפות את יחסי המבנה-פונקציה של התחום המופרע באופן מהותי של גורמי שעתוק אונקוגניים.

Introduction

תת-קבוצה של סוגי סרטן, כולל ממאירות רבות של ילדות והתבגרות, מאופיינות בטרנסלוקציה כרומוזומלית המייצרת היתוך חדשני1,2,3,4,5,6. חלבוני ההיתוך המתקבלים מתפקדים לעתים קרובות כגורמי שעתוק אונקוגניים, ומארגנים שינויים נרחבים בוויסות התמלול כדי לקדם גידול7,8. סוגי סרטן עם טרנסלוקציות אלה בדרך כלל יש נוף מוטציה שקט אחרת, עם כמה סטיות גנומיות חוזרות ונשנות מלבד היתוך פתוגנומי4,9. ככזה, מיקוד ישיר של חלבון ההיתוך היא אסטרטגיה טיפולית אטרקטיבית במחלות אלה. עם זאת, גורמי שעתוק אונקוגניים אלה מורכבים בדרך כלל ממורכבות נמוכה, הפרעה מהותית, הפעלה של תחום תמלול התמזג עם תחום מחייב DNA (DBD)10,11,12,13,14. הן התחומים המופרעים באופן מהותי (IDDs) ו- DBDs של חלבונים אלה הוכחו כקשים למיקוד עם גישות פרמקולוגיות קונבנציונליות. פיתוח גישות טיפוליות חדשניות, אם כן, דורש הבנה מולקולרית מפורטת יותר של המנגנונים המופעלים על ידי היתוך זה כדי לווסת באופן חריג את ביטוי הגנים.

חלק ה- N-terminal IDD של EWSR1 מותך בדרך כלל ל- DBD בסרטן, כולל EWS / FLI בסרקומה יואינג, EWS / WT1 בגידול תאים עגולים קטנים מפוזרים, ו- EWS / ATF1 בסרקומה של תאים ברורים של חלקיםרכים 10. התפקיד המכניסטי של EWS IDD בכל אחד מהיתוך אלה אינו מובן לחלוטין. משפחת ההיתוך של EWS/ETS, במיוחד EWS/FLI, היא המאופיינת ביותר מבחינה תפקודית עד כה. EWS/FLI מרכז שינויים אפיגנטיים ותעתיקיים ברחבי הגנום המובילים להפעלה ודיכוי של אלפיגנים 7,11,15,16. מחקרים הראו כי IDD חשוב לגיוס של שני מפעילים משותפים תמלול (כגון p300, WDR5, ואת מתחם BAF), כמו גם מדכאים משותפים (כגון מתחם NuRD)11,15,17. ההיתוך של EWS IDD לחלק C-מסוף של FLI1 מעניק ספציפיות חדשה מחייבת DNA ל- ETS DBD של FLI1, כך שהיתוך oncoprotein (EWS / FLI) נקשר לאזורי GGAA-מיקרוסטלייט חוזרים ונשנים של הגנום בנוסף למוטיב ETS הקונצנזוס18,19,20. בשילוב עם פונקציית גיוס שיתוף מפעיל, פעילות מחייבת DNA המתהווה של EWS / FLI מקדמת היווצרות משפר דה נובו ב- GGAA-microsatellites דיסטליים לאתרי התחלה של תמלול (TSS) (מיקרוסטליטים “דמויי שיפור”) ומגייסת RNA פולימראז II לקידום שעתוק ב- GGAA-microsatellites הקרוב ל- TSS (“מקדם דמוי” מיקרוסטליטים)11,15,16,21.

יחד, נתונים אלה הובילו אותנו לשער כי אלמנטים נפרדים בתחום EWS תורמים לגיוס רגולטורים משותפים נפרדים לסוגים שונים של אתרי איגוד EWS / FLI. עם זאת, הבחנה באלמנטים אלה בתוך החלק EWS של EWS / FLI, וכיצד הם מתפקדים, הופרעה על ידי האופי החוזר ונשנה ביותר של התחום. כאן אנו משתמשים במערכת נוקאאוט-הצלה שפורסמה בעבר בתאי סרקומה יואינג כדי למפות באופן פונקציונלי את האלמנטים האלה ב- EWS IDD. במערכת זו EWS/ FLI מתרוקן באמצעות shRNA מיקוד 3’UTR של הגן FLI1, וביטוי הוא הציל עם מבנים מוטנטיים EWS / FLI שונים חסר 3’UTR7,17,22. ניסויים אלה התמקדו במבנים עם מחיקות שונות כדי למפות את הקשר בין EWS IDD לבין פנוטיפים אונקוגניים חשובים, כולל הפעלה של מבנה כתב GGAA-microsatellite, בדיקות היווצרות מושבה, ואימות ממוקד של גנים המופעלים על ידי EWS / FLI ומודחקים7,17,22 . עם זאת, מחקרים אלה לא הצליחו למצוא תת-תחומים נפרדים בתוך מזהה EWS ב- EWS/FLI החשובים באופן ייחודי להפעלה או לדיכוי. כל המבנים שנבדקו היו מסוגלים להפעיל ולהדחיק גנים ספציפיים של יעד, מה שהוביל להיווצרות מושבה יעילה, או לא הצליחו לווסת אף אחד מהגנים של היעד EWS / FLI, מה שהוביל לאובדן היווצרות המושבה7,17,22.

ניתוחי תמלול המתאפשרים על ידי אימוץ נרחב של רצף הדור הבא משמשים בדרך כלל כדי להשוות חתימות ביטוי גנים בשני תנאים, לעתים קרובות בהקשר של סינון או מחקרים תיאוריים. במקום זאת רצינו למנף את היכולת ללכוד נתוני ביטוי כלל-גנום באמצעות ריצוף RNA (RNA-seq) כדי לאפיין את התרומות של מזהים לתפקוד גורם התמלול. במקרה זה RNA-seq משויך למערכת הנוקאאוט-הצלה כדי לחקור את קשרי המבנה-פונקציה של קבוצת המחשבים EWS. גישה זו חלה על גורמי שעתוק היתוך אחרים, כולל היתוך EWS אחרים או גורמי שעתוק של סוג בר עם פונקציה לא מובנת היטב, ויש לה יתרונות מרובים על פני בדיקות אחרות המשמשות למחקרי מיפוי פונקציונליים, כגון בדיקות עיתונאים או qRT-PCR ממוקד. אלה כוללים בדיקת דטרמיננטים מבניים של פונקציה בהקשר הכרומטין הרלוונטי, היכולת לבדוק סוגים מרובים של רכיבי תגובה בבדיקה אחת (כלומר, מופעל ומודחק, GGAA-microsatellite ולא microsatellite, וכו ‘), ואת היכולת וכתוצאה מכך לזהות טוב יותר פונקציה חלקית.

יישום מוצלח של גישה זו תלוי במערכת מבוססת תאים הלוכדת את הפנוטיפים של עניין (במקרה זה תאי A673 עם דלדול EWS / FLI בתיווך shRNA), ופאנל של מבנים מוטנטיים בווקטור ביטוי המתאים למערכת מבוססת התא (במקרה זה, pMSCV-hygro עם מוטציות EWS / FLI מתויגות 3x-FLAG שיועברו על ידי טרנסדוקציה רטרו-ויראלית). התמהר ויראלי של מבני דלדול מבוססי CRISPR, מבני דלדול מבוססי SHRNA ומבנה ביטוי cDNA עם בחירה מתאימה ליצירת קווי תאים יציבים מומלץ על פני זיהום ארעי. הפרשנות במורד הזרם של התוצאות מתחזקת כאשר ניתן לזווג את הנתונים התמלוליים עם נתונים אחרים הקשורים לוקליזציה של גורם התמלול וקריאה פנוטיפית אחרת במידת האפשר.

במאמר זה, אנו מיישמים גישה זו כדי לאפיין את הפעילות של מוטציית DAF של EWS / FLI14. מוטציית DAF יש 17 טירוזין למוטציות אלאנין באזורים החוזרים ונשנים של EWS IDD של EWS / FLI14. מוטציה מסוימת זו של EWS דווחה בעבר ואינה מסוגלת להפעיל ביטוי גן כתב כאשר הותכה ל- ATF1 DBD14. עם זאת, נתוני qRT-PCR ראשוניים הראו כי מוטציה זו הצליחה להפעיל את התמלול של יעד EWS / FLI NR0B123. הגישה התמלולית המתוארת כאן אפשרה זיהוי מוצלח של תפקוד חלקי של מוטציית DAF. על ידי שיוך נתונים תמלוליים אלה עם מידע על EWS / FLI איגוד ומוטיבים זיהוי אנו מראים עוד יותר כי מוטציית DAF שומרת על פונקציה ב GGAA-microsatellite חוזר. תוצאות אלה מזהות את DAF כמוטנט EWS/FLI הראשון בתפקוד חלקי ותפקוד הדגשה בגנים שאינם מיקרו-סטליטים כחשובים לאונקוגנזה (כפי שדווח23). זה מדגים את העוצמה של גישה זו של מיפוי מבנה-פונקציה של שעתוק כדי לספק תובנה על הפונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים.

Protocol

1. הגדירו בלוח ההסדרה של מבנים הערה: שלב זה ישתנה בהתאם לחלבון הספציפי שיש לנתח. הכן aliquots של וירוס עבור מבנים דלדול וביטוי לפי הצורך. זרע צלחת תרבית רקמות 10 ס”מ עם 3-5 x 106 HEK293-EBNA או HEK293T תאים עבור כל מבנה הדרוש עבור טרנסדוקציה ויראלית. תנו לתאים לדבוק בן לילה במדיה הנשר המותאמת (DMEM) של דולבק בתוספת סרום בקר עוברי 10%,פניצילין/סטרפטומיצין/גלוטמין (P/S/Q) ו-0.3 מ”ג/מ”ל G418.הערה: תאי HEK293-EBNA ו- HEK293T מומלצים לייצור ויראלי מכיוון שהם קלים לגידול, בעלי יעילות העברה גבוהה, ומבטאים ביעילות חלבונים רקומביננטיים מפלסמידים אפיסומליים. התאים צריכים להיות בין 50-70% מפגש ביום של transfection. הכן תערובת טרנספקטו עבור כל מבנה טרנסדוקציה ויראלי. שלב 2 מ”ל של מדיה בסרום מופחת עם 90 μL של ריאגנט transfection.הערה: מומלץ להפחית את התחממותו של סרום. הוסף 10 מיקרוגרם כל אחד מפלטת אריזה ויראלית (למשל, gag-pol), מעטפת ויראלית plasmid (למשל, VSV-G), ואחד של דלדול מבוסס CRISPR, דלדול מבוסס shRNA, או מבנה ביטוי cDNA (למשל, pMKO או pMSCV) לתערובת transfection. מערבבים היטב על ידי צנרת עדינה. תן את תערובת transfection לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר HEK293-EBNA צמיחה מדיה מן תרבית רקמות ולהוסיף 3 מ”ל DMEM בתוספת 10% FBS, P / S / Q, ו 10 mM נתרן pyruvate. לכל מנה, מוסיפים 2 מ”ל של תערובת טרנספקטו זרוקה. תנו לתאים לשבת בתקשורת טרנספקטו לילה באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת בבוקר להוסיף 20 מ”ל של מדיה DMEM עם 10% FBS, P / S / Q תוספי, ו 10 mM נתרן pyruvate. לדגור על התאים בו ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 למשך הלילה. למחרת בבוקר, להחליף מדיה עם מדיה אוסף ויראלי 5 מ”ל (VCM) (DMEM בתוספת 10% חום מומת FBS, P / S / Q, ו 20 mM HEPES). לאחר 4 שעות, לאסוף VCM מצלחות ולאחסן צינור חרוט 50 מ”ל על קרח ב 4 °C (70 °F). החלף ב- 5 מ”ל של VCM טרי. לאחר 4 שעות, לאסוף VCM מצלחות באותו צינור חרוט 50 מ”ל ולאחסן על קרח ב 4 °C (70 °F). החלף ב- 8 מ”ל של VCM טרי לאיסוף לילה. בבוקר לאסוף VCM מצלחות ולאחסן בצינור חרוט 50 מ”ל על קרח ב 4 °C (5 °F). החלף ב- 5 מ”ל של VCM טרי. לאחר 4 שעות, לאסוף VCM מצלחות ולאחסן בצינור חרוט 50 מ”ל על קרח ב 4 מעלות צלזיוס. החלף ב- 5 מ”ל של VCM טרי. לאחר 4 שעות, לאסוף VCM מצלחות ולהוסיף צינור חרוט 50 מ”ל. אוספי Aliquot מצינור 50 מ”ל לתוך קריוטיוב (2 מ”ל לכל aliquot) לאחר סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. יש לאחסן עליקוטים ויראליים ב-80 °C (70 °F) עד לשימוש.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, ואת aliquots ויראלי ניתן לאחסן עד מוכן לשימוש. תאי זרעים בצפיפות המתאימה בצלחת תרבית רקמות של 10 ס”מ. יעד 50% מפגש. תן לתאים לדבוק לילה על ידי הצבת אינקובטור ב 37 °C המכיל 5% CO2.הערה: עבור תאי A673 זהו 5 x 106 תאים ב 10 מ”ל של מדיה DMEM עם 10% FBS, תוספי P / S / Q, ו 10 mM נתרן פירובט. תנאים אלה עשויים להשתנות בהתאם לקצב הצמיחה של התאים המשמשים. לרוקן גורם אנדוגני של עניין. אם תאים לא צריכים לרוקן את החלבון האנדוגני של העניין, דלג קדימה לשלב 1.4. להפשיר aliquot ויראלי עבור טרנסולקציה של shRNA או קריספר לבנות מיקוד חלבון של עניין. להפשיר עליקוטים קפואים במהירות באמבט מים 37 °C .C. הוסיפו 2.5 מיקרו-אל של 8 מ”ג/מ”ל פוליברן לכל עליקוט נגיפי וערבבו על ידי צנרת עדינה. מוציאים את המדיה מלוחות התאים ומוסיפים בעדינות עליקוט ויראלי לצלחת של 10 ס”מ על ידי צנרת לאורך צד הצלחת. רוק הצלחת כדי להפיץ את 2 mL של aliquot ויראלי. דגירה ב 37 °C (55 °F) באינקובטור תרבית הרקמות עבור 2 שעות. רוק את הצלחת כל 30 דקות כדי למנוע כל אזורים של הצלחת להתייבש. הוסף 5 מ”ל של מדיה DMEM עם 10% FBS, תוספי P / S / Q, ו 10 mM נתרן pyruvate, עם 5 μL של 8 מ”ג / מ”ל polybrene. תן לתאים לדגור בן לילה. בבוקר להסיר מדיה מתאים ותאי מעבר למדיה בתוספת ריאגנט בחירה. כאשר עוברים תאים, זרע אותם באופן שיאפשר להם לגדול במשך 48-72 שעות ולהגיע 50% השפעה.הערה: עבור תאי A673 עם pSRP-iEF-2, תאים נזרעים בפיצול של 1:5 ונבחרים ל- 72 שעות עם 2 מיקרוגרם / mL puromycin. מבנים של ביטוי cDNA של התמתן. בדוק תאים כדי לאשר 50-70% מפגש. להפשיר aliquot ויראלי(ים) עבור טרנסולקציה של cDNA מבנים(ים) של עניין. להפשיר עליקוטים קפואים במהירות באמבט מים 37 °C .C. מוסיפים 2.5 μL של 8 מ”ג /מ”ל פוליברן לכל aliquot ויראלי ומערבבים על ידי pipetting בעדינות. הסר מדיה מתאים מצופים בעדינות להוסיף aliquot ויראלי לצלחת 10 ס”מ על ידי pipetting לאורך הצד של הצלחת. רוק הצלחת כדי להפיץ את 2 mL של aliquot ויראלי. דגירה ב 37 °C (55 °F) באינקובטור תרבית הרקמות עבור 2 שעות. רוק את הצלחת כל 30 דקות כדי למנוע כל אזורים של הצלחת להתייבש. הוסף 5 מ”ל של מדיה DMEM עם 10% FBS, תוספי P / S / Q, ו 10 mM נתרן pyruvate, עם 5 μL של 8 מ”ג / מ”ל polybrene. תן לתאים לדגור בן לילה. בבוקר הסר מדיה מתאים ותאי מעבר למדיית בחירה כפולה. הגדלו והמעבר של תאים לפי הצורך במשך 7-10 ימים כדי לאפשר בחירה כפולה וביטוי של מבנה cDNA.הערה: פיצול זה של מעבר זה עשוי לדרוש מיטוב עבור קווי תאים שונים. עבור תאי A673 עם pSRP-iEF-2 ומבנה pMSCV-hygro, תאים מועברים מבלי להתפצל ל-2 מיקרוגרם/מ”ל פרומיצין ו-100 מיקרוגרומיצין/מ”ל. 2. לאסוף תאים, לאמת ביטוי של מבנים, ולהגדיר מבדים פנוטיפיים קורלטיביים לאחר 7-10 ימים של בחירה כפולה לאסוף תאים בצינור חרוט 15 מ”ל. ספירת תאים שנאספו עם המוציטומטר. Aliquot אסף תאים עבור ריצוף RNA ולאימות ביטוי של מבני cDNA.הערה: הגדר כל בדיקה פנוטיפית קורלטיבית הנדרשת על ידי שאלת המחקר הנחקרת. מושבה היוצרת מבאיות הן דוגמה של מבאי פנוטיפי קורלטיבי המשמשים כאן. לאסוף בין 5 x 105 ו 1 x 106 תאים עבור RNA-רצף ו 2 x 106 תאים להפקת חלבון. כדורי תאים על ידי centrifugation ב 1,000 x גרם ב 4 °C (5 דקות) ולהסיר את supernatant. לשטוף את הכדור עם PBS קר 1 מ”ל. גלולה על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם ב 4 °C (5 דקות) ולהסיר supernatant. פלאש להקפיא כדורי חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 °C (80 °F). הגדר כל תוחם מתאם עם התאים הנותרים.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן עם דגימות שנאספו מאוחסנות במקפיא -80 °C .C. לאמת את ההשבתה של חלבון של עניין (אם נעשה שימוש) וביטוי של לוח המבנים. להפשיר כדורי תא להפקת חלבון על קרח. תאים resuspend בקור קרח 500 μL חוצץ חילוץ גרעיני (20 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 10% גלצל, 1.5 מ”מ MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% IGEPAL) עם מעכב פרוטאז. תן לו לשבת במשך 5 דקות על קרח. גרעיני פלטה על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם ב 4 °C (5 דקות) ולהסיר supernatant. לשטוף גרעינים ב 500 μL קרח קרח חיץ מיצוי גרעיני (20 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 10% גליצלול, 1.5 מ”מ MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% IGEPAL) עם מעכב פרוטאז. גרעיני פלט על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם ב 4 °C (5 דקות) ולהסיר את supernatant. גרעינים resuspend ב 200 μL חיץ RIPA קר עם מעכב פרוטאז (להתאים את הנפח של מאגר RIPA בהתאם לגודל גלולה.) תן לו לשבת על קרח במשך 45 – 60 דקות עם מערבולת נמרצת כל 15 דקות. פסולת תאי כדורית על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם ב 4 °C (45-60 דקות). שמור את supernatant ולהעביר לצינור קר טרי הכן דגימות עבור אלקטרופורזה SDS-PAGE על ידי רותחים 5-10 מיקרוגרם של חלבון עם חוצץ טעינה 1x במשך 5 דקות. הפעל ג’ל SDS-PAGE כנדרש לחלבון מעניין. העבר חנקן או קרום PVDF לפי הצורך עבור חלבון של עניין. לחסום, ולהכתים עם הנוגדנים העיקריים והמשניים המתאימים כדי לאשר את ההנמקה של החלבון האנדוגני (אם נעשה שימוש) וביטוי חוץ רחמי של מבנה cDNA.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לחלץ RNA. הערכת איכות וכמות ה- RNA. להפשיר כדורי תא על קרח. לחלץ RNA הכולל באמצעות ערכת מיצוי מבוסס ספין-טור סיליקה בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, יש לתכנת את התאים באמצעות מאגר תמוז מהערכה. או להחיל את lysate על סיליקה ספין-טור עם ספין קצר ב >13000 סל”ד במשך 30-60 שניות או להסיר gDNA על ידי החלת lysate על עמודת הסרת gDNA עם ספין קצר ב >13000 סל”ד במשך 30-60 שניות. בצע עיכול DNA על עמודה אם ליסאט הוחל ישירות על עמוד ספין סיליקה. אם משתמשים בעמודת הסרת gDNA, החל את ה- eluate על עמודת סיליקה-ספין עם סיבוב קצר ב- >13000 סל”ד עבור 30-60 s. לשטוף RNA בעמודה בהתאם להוראות היצרן. Elute RNA ב 30 μL של חוצץ elution. להעריך את איכות ה- RNA ואת כמותם באמצעות פלואורומטר, או כל מכשיר דומה אחר. ודא שיחס 260/280 קרוב ל- 2 וכי יש לפחות 2.5 מיקרוגרם של RNA לשליחה לרצף.הערה: כאשר נאספים שכפולים, יש לעבד כל שכפול עם אותו פרוטוקול חילוץ RNA. השתמש aliquot קטן של RNA כדי לאשר את ההשבתה היציבה של חלבון עניין, במידת הצורך, על ידי qRT-PCR. אחסן את דגימת הרנ”א הנותרת במהירות של -80 °C (70 °F). לאסוף שכפולים ביולוגיים על ידי חזרה על שלבים 1-2 עד 3-4 קבוצות שלמות של RNA נאספו. ודא כי כל שכפול מציג ביטוי הולם של מבני cDNA ו נוקאאוט יציב של חלבון אנדוגני (אם נעשה שימוש). 3. רצף הדור הבא שלח RNA שחולץ לרצף באמצעות פלטפורמת ריצוף הדור הבא עם יעד של 50 מיליון קריאות קצה מזווגות של 150 זוגות בסיסים (bp). בצע את ההוראות של המתקן עיבוד הדגימות. בחר עבור RNAs פולי-adenylated ורצף ספציפי לגדיל. 4. יישור וצינור ספירת תעתיק הערה: פרוטוקול זה מניח שלאחר שליחה ועיבוד לדוגמה, קבוצה של קבצי FASTQ משויכים מוחזרים עבור כל דוגמה. קבצים אלה נדחסים לעתים קרובות עם סיומת של “fastq.gz”. ניתוח נוסף של קבצי FASTQ אלה ידרוש גישה למתקן מחשוב בעל ביצועים גבוהים (HPC) המפעיל מערכת הפעלה Linux. העבר קבצים פתח מסוף לסביבת HPC באמצעות PuTTY. הפוך ספריה לניתוח הנקרא “פרוייקט”. נווט לספריה “path_to/פרוייקט” ובצע ספריה חדשה עבור קבצי fastq הגולמי הדחוס.gz הנקראים “fastq”. גם לעשות ספריה בשם “קצוץ”. זה מוצג באיור S1A-C. העבר את קבצי fastq הגולמי הדחוס.gz מאחסון מקומי לספריה “path_to/project/fastq/” באמצעות WinSCP או תוכנית דומה. ודא שיש קובץ “R1” ו- “R2” עבור כל דגימה כפי שמוצג באיור S1B. אופציונלי: במידת הצורך, התקן את TrimGalore. הגדר את הספריה המכילה את קובץ ההפעלה trim_galore במשתנה הסביבה PATH ב- Linux.הערה: קריאות ומתאמים באיכות נמוכה נחתכים באמצעות TrimGalore. TrimGalore זמין בשעה https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore. אופציונלי: נווט לספריה עבור חבילות תוכנה שהורדו (כלומר “path_to/תוכנה”). הורד את חבילת TrimGalore העדכנית ביותר באמצעות הפקודה “תלתל -fsSL https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/[גירסה].tar.gz -o trim_galore-[גירסה].tar.gz.” אופציונלי: פרק את קובץ .gz הזפת. השתמש בפקודה “tar -xvzf trim_galore-[version_number].tar.gz”. אופציונלי: הפוך את TrimGalore לניתן להפעלה. השתמש בפקודה “chmod a+x path_to/תוכנה/TrimGalore-[גירסה]/trim_galore”. ודא שספריה חדשה זו נמצאת בנתיב. השתמש בפקודה “ייצוא PATH=path_to/תוכנה/TrimGalore-[גירסה]:$PATH”. נווט אל path_to/פרוייקט/fastq/. השתמש ב- TrimGalore כדי לקצץ את הקריאות באיכות נמוכה מהקבצים המהירים.gz באמצעות הפקודה המוצגת באיור S1C.הערה: דגלים נוספים עבור פקודה זו עשויים להיות רלוונטיים וניתן למצוא אותם כאן: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/blob/master/Docs/Trim_Galore_User_Guide.md בדוק אם קיימים הקבצים המקווים .gz fastq בספריה path_to/פרוייקט/גזוז. ודא שהם נקראים sample1_R1_val_1.fq.gz ו- sample1_R2_val_2.fq.gz ישר קבצי FASTQ חתוכים עם STAR וצור ספירות תעתיק.הערה: STAR זמין ב-https://github.com/alexdobin/STAR) אופציונלי: התקן את STAR גירסה 2.6 ואילך. הגדר את קובץ ההפעלה STAR בנתיב. אופציונלי: נווט לספריה עבור חבילות תוכנה שהורדו (כלומר “path_to/תוכנה”). אופציונלי: הורד את חבילת STAR באמצעות הפקודה “תלתל -SLO https://github.com/alexdobin/STAR/archive/[גירסה] .tar.gz”. לפרוק את קובץ .gz הזפת. אופציונלי: השתמש בפקודה “tar -xzf [גירסה].tar.gz”. הפוך את STAR לניתן להפעלה. השתמש בפקודה “chmod a+x path_to/תוכנה/STAR-[גירסה]/סל”. אופציונלי: ודא שספריה חדשה זו נמצאת בנתיב. השתמש בפקודה “ייצוא PATH=path_to/תוכנה/STAR-[version_number]/bin/linux_x86_64_static:$PATH”.הערה: מדריך STAR זמין ב: (https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf). ודא שיש אינדקס גנום לשימוש עם STAR. מקם זאת בספריה נפרדת מהספריה path_to/פרוייקט/מדריך הכתובות. אם אינדקס נוצר בעבר עבור ניסויים קודמים, השתמש בו. לחלופין, השתמש באינדקס מתאים שנוצר מראש אם הוא זמין כאן: http://refgenomes.databio.org/. אחרת, בנה אינדקס חדש באמצעות הפקודה “STAR –runMode genomeGenerate” באמצעות ההוראות במדריך STAR.הערה: עבור שארית פרוטוקול זה הנתיב לאינדקס STAR ייקרא “path_to/STAR_index”. נווט אל path_to/פרוייקט/ספריה. הכינו ספריה חדשה בשם “STAR_output” כפי שמוצג באיור S1D. נווט אל path_to/פרוייקט/חיתוך/ספריה. השתמשו בפקודה המוצגת באיור S1D להפעלת STAR כדי ליישר את הקבצים המקווים במהירות.gz.הערה: שלב זה הוא האינטנסיבי ביותר מבחינה חישובית ומומלץ לבצע זאת באשכול HPC עם הליכי משנה מרובים (כלומר >16) המיועדים למשימת היישור. בהתאם למספר הדגימות והמשאבים החישוביים הזמינים שלב זה עשוי להימשך שעות רבות עד ימים. חפש את הפלט הנדרש עבור השלבים הבאים המכילים את הספירה לכל תעתיק במיקום הבא: path_to/project/STAR_output/sampleN_ReadsPerGene.out.tab.הערה: בעמודת הקובץ ReadsPerGene.out.tab 1 מכיל מידע אודות התכונה הנספרת. עמודה 2 מכילה את ספירות הקריאה הלא מתוחות, עמודה 3 מכילה את ספירות הקריאה התקועות קדימה ועמודה 4 מכילה את ספירת הקריאה התקועה ההפוכה. בארבע השורות הראשונות של קובץ זה יצוין מידע אודות הקריאות המיושרות שלא התיישרו לגן יחיד. פרוטוקול זה דורש את ספירת הקריאה הלא מחייבת. השתמש ב- RStudio (עדיף) או R בסביבת HPC כדי להדר את הנתונים משורה 5 ומטה עבור עמודות 1 ו- 2 עבור כל מדגם. הגדר את ספריית העבודה כ-“project” ב- R. קרא בכל קובץ ReadsPerGene.out.tab באמצעות הפקודה באיור S2A. עבור העמודה הראשונה, קח רק את התווים לפני ה- “.” בעמודה “מזהה גן Ensembl” לקבלת הקלות של עיבוד במורד הזרם. בצע קומפילציה מכל הדגימות למחשב נתונים הנקרא “totcts” באמצעות הפקודות באיור S2B. שמור טבלה חדשה זו של נתוני ספירה גולמית כקובץ .txt מופרד באמצעות כרטיסיה, כלומר sample_counts.txt, אם תרצה, באמצעות הפקודה “write.table”.הערה: הסדר של מזהה הגן של Ensembl זהה עבור כל קובץ ReadsPerGene.out.tab בין דוגמאות. 5. ביטוי דיפרנציאלי וניתוח במורד הזרם נרמלו עבור אפקטי אצווה בין דגימות עם ComBat.הערה: ישנם שני משתנים אפשריים המסבירים שינויים בביטוי הגנים, הראשון הוא המבנה המשמש (כלומר המדגם) והשני הוא גורמים חיצוניים הקשורים למעבר התאים לאורך זמן (כלומר האצווה). מומלץ לשלב לנרמל דוגמאות עבור וריאציה של אצווה לאצווה עם ComBat של חבילת R. התקן במידת הצורך וטען את הספריות עבור sva, DESeq2, ביאורDBI ו- org. Hs.eg.db, pheatmap, RColorBrewer, genefilter, קהיר, ggplot2, ggbiplot, rgl, ועצב מחדש2 כפי שמוצג איור S2C. להתקנה, השתמש בפקודה “install.packages” או ב- Bioconductor לפי התיעוד עבור כל חבילה. סנן תחילה את הנתונים רק לגנים בעלי ספירה אחת לפחות לקריאה. שמור טבלה חדשה זו כדי לציין סינון כפי שניתן לראות באיור S2D.הערה: לעתים קרובות, גנים רבים יהיו נמוכים מאוד או ללא ספירת קריאה. הכן טבלה שנייה לנורמליזציה של אצווה הנקראת “VARs” כפי שמוצג באיור S2E. הגדר את שמות השורות לשמות הייחודיים של כל דוגמה. הגדר את שמות העמודות כ”מדגם”, “אצווה” ו-“בנה”. הקצה את כל הדגימות למספר ייחודי בעמודה “מדגם” מ- 1 עד n, כאשר n הוא מספר הדגימות. הקצה מספרי אצווה לכל הדגימות בעמודה “אצווה”, כך a_1 תנאי b_1 תנאי מוקצים שניהם 1, a_2 תנאי b_2 תנאי מוקצים שניהם 2. הקצה את כל ייעודי התנאי לכל הדגימות בעמודה “לבנות” כך שדגימות תנאי-a הן כולן דגימות “A” ודגימות תנאי-b הן כולן “B”. הגדר גם את משתנה האצווה ואת מטריצת דגם ה- Null הספציפית עבור ComBat כפי שמוצג באיור S2F. הפעל את ComBat עם הפקודה המוגדרת באיור S2F. אוצר עוד יותר את הנתונים על-ידי עיגול אל מספר שלם הקרוב ביותר. כמו כן להסיר גנים עם ערך שלילי. השתמש בפקודות המוצגות באיור S3A.הערה: הפלט של נורמליזציה אצווה יהיה ספירת קריאה שאינה שלם וכמה גנים עם ערכים שליליים. שלב זה נדרש מכיוון שניתוח הביטוי הדיפרנציאלי במורד הזרם אינו תומך בספירות קריאה שליליות. הגדר את פרופיל הביטוי הדיפרנציאלי עבור כל מבנה באמצעות DESeq2. הזן את תכנון הניסוי עבור DESeq2 כפי שמוצג באיור S3B. בנו DESeqDataSet (dds) באמצעות הפונקציה DESeqDataSetFromMatrix, העריכו את גורמי הגודל והפעילו את DESEq2, כפי שמוצג באיור S3B.הערה: חובה על מנת שתוני העמודה שהוזנו עבור “תנאי” יהיה באותו סדר כמו העמודה במטריצת הספירה. כדי להעריך את איכות הניתוח, חלץ את ספירות rlog מנורמל בשימוש על ידי DESeq2 כפי שמוצג איור S3B.הערה: במהלך הניתוח, DESeq2 משנה ספירות עם “יומן סדיר”, rlog, טרנספורמציה כדי לכווץ את ההבדלים מדגם לדגימה עבור גנים עם ספירות נמוכות (מידע נמוך) על מנת לשמר הבדלים בגנים עם ספירות גבוהות יותר על פני דגימות (מידע גבוה). בשעת חילוץ התוצאות עבור כל פרופיל תמלול מתוצאות DESeq2, בצעו השוואות זוגיות בהתייחס למצב ההשבתה או לווקטור הריק הבסיסי כפי שמוצג באיור S3C. תיקון נוסף של תוצאות אלה בעזרת סמלי הגן HGNC כפי שמוצג באיור S3D. כפי שניתן לראות באיור S3E, חילוץ נתונים מתוצאות DESeq2. יצא כקובץ יחיד עם מזהה הגן של Ensembl, סמל HGNC, ביטוי ממוצע בסיס וביטוי דיפרנציאלי עבור כל המבנים עם log2FoldChange וערכי p גולמיים ומותאמים.הערה: שימוש בערך p מותאם < 0.05 הוא הניתוק המומלץ לביטוי דיפרנציאלי. הערכת נורמליזציה מוצלחת של אצווה ודמיון פנים-מדגמי. בדוק קיבוץ באשכולות לדוגמה באמצעות PCA ותיוות מרחק לדוגמה באמצעות ספירות rlog מנורמלות באמצעות הקוד המוצג באיור S4A-B. השתמש בפרופילי הביטוי הדיפרנציאליים כדי ליצור חלקות הר געש באמצעות הקוד באיור S4C. להעריך שינויים בביטוי גנים על-פני מבנים. השתמש בספירות המנורמלות של הרלוג ובאשכולות הירארכיים כדי לזהות חתימות גנים ייחודיות למבנים השונים. השתמש בקוד המוצג באיור S4D. לחלץ את 1000 הגנים המשתנים ביותר על פני כל המבנים במטריצה. השתמש במפת pheatmap כדי לבצע קיבוץ הירארכי ללא פיקוח של הדגימות שלך בהתבסס על גנים אלה. לחלץ את אשכולות העניין מן dendrogram על ידי החלטה באיזו רמה של אשכולות דנדרוגרמה של עניין מופיעים. הגדר “k” שווה למספר האשכולות ברמה זו. תוסיפו תוסיפו את מפת החום שהוזמן על ידי אשכול כדי לקבוע אילו אשכולות מעניינים כפי שמוצג באיור S5. יצא את רשימת הגנים המשויכים לכל אשכול כפי שהודגם בטבלה S1. השתמש במידע זה כדי לקבוע את הגנים באשכולות של עניין. זהה את התפקידים הביולוגיים עבור אשכולות שונים של גנים שזוהו והשוו בין המעמדות. זה יכול להתבצע באמצעות מגוון של כלים bioinformatics. ToppGene24 משמש כאן והוא זמין באופן חופשי באינטרנט.הערה: ישנם כלים חינמיים רבים הדורשים רק רשימה של גנים כדי להעתיק ולהדביק בשדה באתר אינטרנט. בחר את הכלים האנליטיים המתאימים ביותר לשאלות המחקר הנחקרות. לחלופינית, אם יש נתונים זמינים אודות איגוד גנומי המניע פלט תמלול עבור גורם תמלול של עניין, השווה את תגובת התמלול בגנים הקשורים לאלמנטים מחייבים שונים כדי להעריך עוד יותר את תפקוד המוטציה. 6. השוואה עם פנוטיפים רלוונטיים השווה את פנוטיפים מתאם עם נתוני הפרופיל שעתוק שנוצר ולפרש לפי הצורך.

Representative Results

נתוני qRT-PCR ראשוניים הראו כי מוטציה EWS / FLI בשם DAF, עם טירוזין ספציפי למוטציות אלאנין באזור החוזר על עצמו ומופרע של EWS, שמר על היכולת להפעיל גנים היעד EWS / FLI, אבל לא הצליח להדחיק גנים היעד קריטי23. כדי להבין טוב יותר את הקשר בין שאריות אלה בתחום EWS לבין הפונקציה EWS/FLI, נעשה שימוש בפרוטוקול המתואר לעיל ומתואר באיור 1. A673 תאי סרקומה יואינג הועברו באופן ויראלי עם shRNA מיקוד 3’UTR של FLI1, וכתוצאה מכך דלדול של אנדוגני EWS / FLI. לאחר ארבעה ימים של בחירה, פונקציית EWS / FLI חולצה עם טרנסולציה ויראלית של מבנים מוטנטיים שונים מתויגים EWS / FLI, עם וקטור ריק כשליטה ללא הצלה. מוטציה לא פונקציונלית חסרה את תחום EWS, הנקרא Δ22, שימשה כשליטה שלילית וסוג פראי EWS/FLI, הנקרא wtEF, שימשה כשליטה חיובית(איור 2A). DAF שימש כמבנה הבדיקה, אם כי ניתן להשתמש ביותר ממבנה בדיקה אחד במידת הרצון. תאים נבחרו במשך 10 ימים נוספים כדי לאפשר ביטוי מבנה לייצב ולאחר מכן נאספו עבור RNA (עם שלב הסרת gDNA), חלבון ומושבה להרכיב assays. ארבעה העתקים נאספו וייצוג qRT-PCR וכתמים מערביים המציגים נוקאאוט והצלה יעילים מוצגים באיור 2B-D. יש לציין כי תאים שניצלו על ידי DAF לא הצליחו ליצור מושבות כפי שמוצג באיור 2E, דבר המצביע על טרנספורמציה אונקוגנית לקויה. לאחר השלמת האימות המשכפל ובדיונים פנוטיפיים, RNA הוגש למכון לרפואה גנומית בבית החולים הלאומי לילדים להכנת הספרייה ורצף הדור הבא עם כ -50 מיליון קריאות בסוף זיווג 150 bp שנאספו. הנתונים הוחזרו כקבצים מהירים.gz. קריאות באיכות נמוכה קוצצו מקבצים אלה עם TrimGalore ו- STAR שימש ליישר קריאות לגנום האנושי hg19 ולספור את הקריאות לכל גן. hg19 שימש למטרות תאימות עם ערכות הנתונים האחרות שאוצר עבור EWS/FLI המשמשות בניתוח במורד הזרם. ספירות קריאה אלה שולבו במטריצת ספירה אחת עבור כל הדגימות, ש-6 השורות הראשונות שלהן מוצגות באיור 3. ספירות בוצעו בתחילה דרך DESeq2 ללא נורמליזציה של אצווה, עם זאת, בדיקה חזותית של המרחק מדגם לדגימה הראתה אפקטי אצווה מבלבלים פוטנציאליים כפי שמוצג עם חצים אדומים באיור 4A. זה ככל הנראה התעורר עקב שונות ביולוגית שהוצגה על ידי המעבר של תאים בתרבית והבדלים בעיבוד של כל אצווה. נורמליזציה עבור אפקטי אצווה בוצעה עם ComBat ומומלץ בדרך כלל. המרחקים לדוגמה לדגימה של הנתונים מנורמלים באצווה מוצגים באיור 4B. לאחר נורמליזציה של אצווה, נעשה שימוש ב- DESeq2 ליצירת פרופילי תמלול עבור שלושת המבנים (wtEF, Δ22 ו- DAF) ביחס לקו הבסיס. שים לב כי בעוד תאי A673 “הורים” (חיקוי מדומה והצלה מדומה, הנקראים “iLuc” כאן) נכללו בניתוח הדיפרנציאלי, ההתייחסות לניסוי זה הם התאים עם תאי IEF מרוקנים EWS/FLI, הנקראים תאי iEF. פרופיל התמלול יכול להיווצר עבור חלבון אנדוגני כאן על ידי השוואת מדגם iLuc ל- iEF, וזה עשוי להיות עניין להבין איך מערכת ההצלה עובדת, אבל זה לא המטרה של ניתוח מסוים זה. פרופילי התמלול שנוצרו עבור המוטנטים כוללים פקדים חיוביים (wtEF) ושליליים (Δ22), ביחס ל- iEF, כך שאלה אמורים לתפקד כמדדים למוטנטים אחרים. זה חשוב, כמו השליטה החיובית בדוגמה זו לא לגמרי recapitulate הפונקציה של אנדוגני EWS / FLI כפי שנדון במקום אחר7,23. ניתוח הרכיבים העיקרי (PCA) באיור 5 מצביע על כך שפרופיל התמלול של DAF הוא ביניים בין wtEF ל- Δ22, המאשר פונקציה חלקית. יתר על כן, קיבוץ היררכי של 1000 הגנים המשתנים ביותר על פני דגימות הראה כי DAF נכשל בדיכוי גנים היעד EWS / FLI, ורק באופן חלקי שמר על פעילות הפעלת גנים כפי שמוצג איור 6A ו איור S5. ניתוח ToppGene העלה כי מחלקות הגנים ש-DAF מפעילה שונות מבחינה תפקודית מיעדים המופעלים על-ידי EWS/FLI שבהם DAF אינו פונקציונלי (איור 6B). מעניין, הפונקציה של גנים מופעלים שניצלו על ידי wtEF, אבל לא על ידי DAF, נראה קשור בקרת תעתיק ויסות כרומטין. בהתבסס על התוצאות של התקפות היווצרות המושבה, הגנים מחתימת גן הליבה הזו צריכים להיות מנותחים עוד יותר על תפקידם באונקוגנזה בתיווך EWS / FLI. החשיבות של דיכוי גנים בתיווך EWS / FLI תוארה בעבר17. ידוע כי EWS / FLI בעל זיקה מחייבת ייחודית עבור אלמנטים חוזרים GGAA-microsatellite19,22, וכי כריכה באלמנטים אלה מניעהבמורד הזרם רגולציה גנים 11,15,18,20,22. מיקרו-סטליטים אלה אופיינו כמזוהים עם הפעלה או דיכוי, וקרובים ל- TSS ( 5 kb) TSS25. בנוסף, ישנם גנים מווסתים EWS / FLI עם זיקה גבוהה (HA) מוטיבים ETS פרוקסימלי TSS23. על מנת לנתח עוד יותר את המאפיינים של פונקציית DAF ואת סוגי הגנים המופעלים על ידי EWS / FLI ש- DAF הצליח להציל, נותח ביטוי דיפרנציאלי של גנים הקשורים למעמדות שונים אלה. מעניין לציין ש-DAF הצליחה להציל גנים המופעלים על ידי GGAA-microsatellite, אך לא הצליחה להציל גנים מופעלים ליד אתר HA כפי שניתן לראות באיור 7. כפי שניתן לראות באשכולות היררכיים, DAF נכשל להציל דיכוי בתיווך EWS / FLI על פני מחלקות מוטיב. נתונים אלה מצביעים על כך ש- DAF שומר על תכונות מבניות מספיקות של EWS כדי לאגד ולהפעיל מ- GGAA-microsatellites, הן פרוקסימלי והן דיסטלי ל- TSS. זה נובע ככל הנראה מתחום SYGQ שלם שנחשב חשוב לפעילות EWS / FLI ב GGAA חוזר11. נתונים אלה מצביעים גם על כך שהטירוסינוסים הספציפיים שעברו מוטציה ב- DAF ממלאים תפקידים חשובים, אך לא מובנים היטב, ברגולציה גנטית בתיווך EWS / FLI מאתרי HA, כמו גם בדיכוי גנים, המדגישים תחום חשוב של חקירה נוספת. איור 1: זרימת עבודה. תיאור של ההליך שלב אחר שלב לביצוע מיפוי פונקציית מבנה על-ידי transcriptomics. התאים היו מוכנים תחילה לבטא את חבילת המבנים הנדרשת למיפוי פונקציית מבנה. בעקבות הביטוי, תאים נקצרו עבור RNA וחלבון ונחשבו פנוטיפים קורלטיביים. ביטוי המבנים אומת, ותהליך זה חזר על עצמו 3-4 פעמים כדי לאסוף שכפולים ביולוגיים עצמאיים. לאחר מכן הוגש RNA לרצף הדור הבא (NGS). כאשר הנתונים התקבלו, הנתונים קוצצו עבור איכות, יישור וספירות לכל תמליל חושבו. אפקטי אצווה נשלטו עבור וחתימות תמלול וביטוי דיפרנציאלי נקבעו באמצעות DESeq2. ניתן לשלב קיבוץ באשכולות הירארכי וניתוח במורד הזרם המשלב ערכות נתונים אחרות של -omics וניתוח מסלול או פונקציונלי שונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: אימות של ביטוי מבנה ובוחות קורלטיביות. (A)סכמטי המתאר את המבנים שנבדקו בדוגמה זו. (B)אימות של נוקאאוט של EWS / FLI אנדוגני וביטוי של מבנים מתויגים 3X-FLAG על ידי אימונובלוט. (C,D) אימות פעילות מבנה בגן יעד המופעל על-ידי EWS/FLI (C), NR0B1ו- (D)מודחק, TGFBR2, על-ידי qRT-PCR. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת +/. ערכי P חושבו במבחן המשמעות ההגון של טוקי. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005 (E) מושבה סופרת מביקורות רכות אגר שבוצעו כדי להעריך את פעילות השינוי של מבנים. ערכי P חושבו במבחן המשמעות ההגון של טוקי. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005. נתון זה מותאם מאת Theisen, et al.23אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: נתוני ספירה סופיים שאיסוף לניתוח. צילום מסך של 6 השורות הראשונות של קובץ הספירה עם ספירת גנים עבור כל הדגימות להיות מנורמל אצווה וניתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: מפת חום של מרחק מדגם לדגימה. (A)התוויית מרחק לדוגמה לדוגמה המציגה את קיבוץ הדוגמאות של נתוני הספירה הגולמית. דוגמאות המקבצות באשכולות הן לפי אצווה והן לפי דוגמה מסומנות בחצים אדומים. (B)התוויית מרחק לדוגמה לדוגמה לאחר נורמליזציה של אצווה עם ComBat. כאן, דגימות מכל המשכפלים מקבצות יחד, ללא תלות באצווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: תוצאות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי. (A)נתווה ניתוח רכיבים עקרוני (PCA) של החתימות התמלוליות שנוצרו עבור כל הדגימות מציגות קיבוץ תוך-מדגמי חזק וממחישות כי DAF מתווך בין הפקדים החיוביים (wtEF) ושליליים (Δ22). (B)חלקות הר געש המציגות את ה- -log (p-value) שרטטו כנגד log2FoldChange עבור גנים בכל מבנה. גנים בעלי ערך p מותאם 1 נחשבים משמעותיים ומוצגים באדום. לוח 5B מותאם מתייסן, ואח’23אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: קיבוץ היררכי לזיהוי מחלקות גנים. (A)קיבוץ הירארכי של 1000 הגנים המשתנים ביותר בכל המבנים וקו הבסיס, iEF, מציג ש- DAF מציל חלקית הפעלת גנים בתיווך EWS/FLI. (B)אונטולוגיה גנטית (פונקציה מולקולרית) נובעת מ- ToppGene המציגה את ההעשרה התפקודית של גנים המופעלים על ידי EWS / FLI שניצלו או לא ניצלו על ידי DAF. לוח 6B מותאם מתייסן, ואח’23אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: ניתוח מפורט של רכיבי תגובה שונים של גורם תמלול למבנים שונים: (A) סכמטי המתאר את עיבוד הנתונים המשמש ליצירת לוחות (B) ו- (C) על-ידי שילוב ערכות נתונים זמינות אחרות עם הפרופילים התמלוליים כאן. (B,C) אוסף המציג את ההצלה של סוגים שונים של מטרות ישירות EWS / FLI- (B) מופעל ו (C) מודחק מטרות. גנים כלולים היו רק אותם גנים עם ביטוי דיפרנציאלי ניתן לזיהוי על ידי אנדוגני EWS / FLI. בכל תרשים עוגה, אפור מתאר את חלק הגנים שאינם ניצלים על ידי המבנה. אדום מתאר את חלק הגנים המופעלים באופן דיפרנציאלי, וכחול מתאר את חלק הגנים המודחקים באופן דיפרנציאלי. נתון זה מותאם מאת Theisen, et al.23אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור S1: טעינת הקבצים המהירים.gz לסביבת HPC, לגיזום וליישור. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. איור S2: איסוף ספירת קריאות בין דוגמאות והפעלת נורמליזציה של אצווה עם ComBat. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. איור S3: הפעלת DESeq2 וחילוץ תוצאות של ניתוח ביטויים דיפרנציאליים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. איור S4: ניתוח פלט. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. איור S5: קיבוץ הירארכי לזיהוי מחלקות גנים: קיבוץ הירארכי של 1000 הגנים המשתנים ביותר בכל המבנים וקו הבסיס, iEF, ממוין לאשכולות k. במקרה זה k=7, אך פרמטר זה מוגדר על-ידי המשתמש כפי שמוצג באיור S4D. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. טבלה S1: רשימת גנים (מזהה גן אנסמבל) עם ביאור אשכול. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

לימוד המנגנונים הביוכימיים של גורמי שעתוק אונקוגניים חשוב מאוד כדי להבין את המחלות שהם גורמים ולתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות. זה נכון במיוחד ממאירות המאופיינת על ידי translocations כרומוזומלי וכתוצאה מכך גורמי שעתוק היתוך. התחומים הכלולים בחלבונים כימריים אלה עשויים להיות חסרי אינטראקציות משמעותיות עם תחומים רגולטוריים הקיימים בחלבונים מסוג בר, מה שמסבך את היכולת לפרש מידע על פונקציית המבנה בהקשר של ההיתוך26,27,28. יתר על כן, רבים מהיתוך oncogenic אלה מאופיינים במורכבות נמוכה תחומים הפרעה מהותית10,13,29,30.

התחום EWS הוא דוגמה לתחום כה מהותי מעורב במגוון היתוך אונקוגני10. הטבע המופרע והחוזר על עצמו הפריע למאמצים להבין את המנגנונים המולקולריים המועסקים על ידי תחום EWS. מאמצים קודמים לחקור את המבנה-פונקציה נקטו במידה רבה להשתמש במוטנטים שונים בהקשר של בדיקות גנים עיתונאיות או ברקע תאים שאינם מצליחים לשחזר את ההקשר התאי הרלוונטי, או חסרים וריאציות מבניות המייצרות פונקציה חלקית משמעותית11,17,25. השיטה המוצגת כאן מטפלת בבעיות אלה. מיפוי פונקציית מבנה מתבצע בהקשר תא רלוונטי למחלה ורצף הדור הבא מאפשר פרופיל תמלולי להעריך פונקציית גורם שעתוק בהגדרת כרומטין מקורי. במקרה הספציפי של מוטציית DAF של EWS / FLI, דווח כי DAF הראה פעילות מועטה בהתקפות עיתונאיות באמצעות אלמנטים של תגובה מבודדת, אך כדי להראות פעילות בהקשר של מקדם הגנים המלא, או בכתב או בכרומטין מקומי, מה שמרמז על פנוטיפמעניין 23. שימוש בשיטה המתוארת כאן באופן ישיר יותר פותר את השאלה איזה סוג של אלמנטים רגולטוריים ברחבי הגנום מגיבים ביותר בסביבת המחלה. על ידי בדיקת כל הגנים היעד המועמד בהקשר הכרומטין המקומי שלהם בו זמנית, גישה transcriptomic סביר יותר לזהות מבנים עם פונקציה חלקית.

הכוח המובנה של שימוש ברקע תאים רלוונטי למחלה הוא אולי המגבלה הגדולה ביותר של טכניקה זו. אחד הגורמים החשובים ביותר הוא בחירת מערכת התא המתאימה לניסויים אלה. קווי תאים רבים הנגזרים ממאירות עם גורמי שעתוק פתוגנומיים אינם סובלים בקלות נוקאאוט של גורם שעתוק זה, ובמקרים רבים, במיוחד עבור סרטן ילדים, תא המקור האמיתי נשאר שנוי במחלוקת וביטוי האונקוגני ברקעים אחרים של התא הוא רעיל באופן אסור31,32 . במקרים אלה, זה עשוי להיות מועיל לבצע ניסויים ברקע תא אחר, כל עוד החוקר נוקט זהירות בפרשנות התוצאות ומאמת כראוי את כל הממצאים הרלוונטיים בסוג תאים רלוונטי יותר למחלה.

חשוב מאוד לאמת בקפידה את היציבות ואת ההשלכות הפנוטיפיות של ביטוי של oncogene ולהגיש רק דוגמאות עבור רצף העונה על קריטריונים קפדניים. כאן, זה כלל כתם מערבי כדי לאשר נוקאאוט והצלה, ו qRT-PCR של מספר קטן של גנים היעד ידוע כדי לאמת את השליטה החיובית (איור 2). זה גם חיוני כדי להקטין כמה שיותר שונות אצווה ככל האפשר על ידי ביצוע בקפידה את התא ואת תכשירי RNA באופן דומה ככל האפשר באמצעות כל אצווה.

השיטה המתוארת כאן הופכת לחזקה במיוחד כאשר היא מזווגת עם סוגים אחרים של נתונים גנומיים המדברים לתפקוד הגנום הרחב של גורם התמלול הנחקר. כיוונים עתידיים עבור סוג זה של ניתוח פונקציית מבנה יתרחבו ויכללו את ChIP-seq ו- ATAC-seq כדי לקבוע את האיגוד של גורם התמלול וכל שינוי מושרה בנגישות הכרומטין. כחבילה, סוג זה של נתונים יכול להצביע על המקום שבו רכיבים מבניים שונים של גורם תמלול oncogenic לתרום היבטים שונים של פונקציה (כלומר כריכת DNA לעומת שינוי כרומטין לעומת גיוס רגולטור שותף). בסך הכל, שימוש בגישות מבוססות NGS כדי למפות את יחסי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק היתוך יכול לחשוף תובנות חדשות בדטרמיננטים הביוכימיים של הפונקציה האונקוגנית של חלבונים אלה. חשוב לקדם את הבנתנו את המחלות שהן גורמות ולאפשר פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מתקן המחשוב בעל הביצועים הגבוהים במכון המחקר אביגיל וקסנר בבית החולים לילדים בפריסה ארצית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן המכונים הלאומיים לבריאות [U54 CA231641 כדי SLL, R01 CA183776 ל- SLL]; קרן דוכן הלימונדה של אלכס [פרס החוקר הצעיר ל- ERT]; פלוטוניה [אחווה ל- ERT]; והמלגה הביו-רפואית של המועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי CJ Martin Overseas [APP111032 ל- KIP].

Materials

Wet Lab Reagents
anti-FLI rabbit pAb Abcam ab15289 1:500
anti-lamin B1 rabbit pAb Abcam ab16048 1:2000
Cell-based system for introduction of mutant constructs Determined by cell system used
Cryotubes For viral aliquots
DMEM Corning Cellgro 10-013-CV For viral production
Fetal bovine serum Gibco 16000-044 For viral production
G418 ThermoFisher 10131027 For viral production
HEK293-EBNAs ATCC CRL-10852 For viral production
HEPES Gibco 15630106
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
M2 anti-FLAG mouse mAb Sigma F3165 1:2000
Near IR-secondary antibodies Li-Cor
Optimem Gibco 31985062 For viral production
Penicillin/Streptomycin/Glutamine Gibco 10378-016 For viral production
Polybrene Sigma TR-1003-G For viral transduction
Puromycin Sigma P8833 Stored at 2 mg/mL stock
RNeasy Plus kit Qiagen 74136 Has gDNA removal columns
Selection reagents As dictated by cell system used
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 For viral production
Tissue culture media Determined by cell system used
TransIT-LT1 Mirus MIR 2304 For viral production
Software
Access to HPC environment
AnnotationDbi 1.38.2
Cairo 1.5-10
DESeq2 1.16.1
genefilter 1.58.1
ggbiplot 0.55
ggplot2 3.1.1
org.Hs.eg.db 3.4.1
pheatmap 1.0.12
PuTTY
R 3.4.0
RColorBrewer 1.1-2
reshape2 1.4.3
rgl 0.100.19
R-studio
STAR Version 2.6 or later
sva 3.24.4
TrimGalore!
WinSCP
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miettinen, M., et al. New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities. Human Pathology. 86, 57-65 (2019).
  2. Knott, M. M. L., et al. Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies. Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).
  3. Yoshihara, K., et al. The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).
  4. Duesberg, P. H. Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).
  5. Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).
  6. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).
  7. Smith, R., et al. Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing’s sarcoma. Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).
  8. Davicioni, E., et al. Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas. Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).
  9. Gröbner, S. N., et al. The landscape of genomic alterations across childhood cancers. Nature. 555, 321-327 (2018).
  10. Kim, J., Pelletier, J. Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members. Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).
  11. Boulay, G., et al. Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain. Cell. 171, 163-178 (2017).
  12. Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene. Oncogene. 10, 423-431 (1995).
  13. Leach, B. I., et al. Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding. Structure. 21, 176-183 (2013).
  14. Ng, K. P., et al. Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).
  15. Riggi, N., et al. EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma. Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).
  16. Tomazou, E. M., et al. Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1. Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).
  17. Sankar, S., et al. Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma. Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).
  18. Gangwal, K., et al. Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing’s sarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).
  19. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing’s Sarcoma. Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).
  20. Guillon, N., et al. The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function. PLoS One. 4, 4932 (2009).
  21. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361, (2018).
  22. Johnson, K. M., et al. Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).
  23. Theisen, E. R., et al. Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis. Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).
  24. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).
  25. Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma. PLOS One. 12, 0186275 (2017).
  26. Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study. Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).
  27. de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer. PLOS One. 4, 4805 (2009).
  28. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).
  29. Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins. PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).
  30. Latysheva, N. S., Babu, M. M. Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches. Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).
  31. Deneen, B., Denny, C. T. Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation. Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).
  32. Kendall, G. C., et al. PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis. eLife. 7, 33800 (2018).

Tags

TranscriptomicsStructure-function AnalysisDisordered Transcription FactorsOncogenic Fusion ProteinsEWS/FLIPartial Function DetectionRNA SequencingCDNA ExpressionVirus TransductionCell CultureSelectionProtein Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Showpnil, I. A., Miller, K. R., Taslim, C., Pishas, K. I., Lessnick, S. L., Theisen, E. R. Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61564, doi:10.3791/61564 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image