マウスペイヤーパッチからの胚芽センターB細胞のJH4イントロンにおける体細胞ハイパー突然変異の解析

フローサイトメトリー成熟したB細胞は、彼らが親和性成熟、クローン拡張、および血漿または記憶細胞40、41、42、43、44への分化を受ける発芽中心に循環する。これらのGCBCは、CD45R/B220受容体の高発現およびピーナッツ凝集(PNA)45、46の結合を含む多数の細胞表面マーカーによって同定することができる。活性化されたGCBCを単離するために、PP細胞をフィコエリスリン(PE)およびビオチン化PNAに結合した抗B220抗体で染色し、続いてAPC-eFluor780に結合したストレプトアビジンを染色した。死細胞は、蛍光4′,6-ディアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)色素を用いて除去し、これは死細胞または死細胞47、48の核酸を染色する。染色された細胞を、その後、フローサイトメトリーを介して分析し、選別した。P は、約 80% B220+セル49,50から構成されていました。WT P には、マウスあたり平均 4 x 106 個のセルが含まれています (図 3A)。WT PP細胞の約8%がB220+PNAHIであり、これはAID-/ – (図3B)で観察された数の半分である。したがって、0.3-0.6 x 106 B220+PNAHI GCBCsは、JH4イントロンの変異を分析するのに十分であった分類後に得られた。 JH4シーケンス解析JH4イントロンは、一般的なVHJ558ファミリープライマー(J558FR3FwおよびVHJ558.2)を用いたネストPCRによって増幅され、次いでプライマーVHJ558.3およびVHJJ558.35,37に及ぶJH4イントロンが続いた。WT GCBCから得られた105個のユニーク配列のうち、合計226個の変異が見つかった(図5A)。WTマウスにおけるGCBC突然変異スペクトルの分析は、4 x10-3突然変異/bpの割合で遷移および転換の範囲を示し、これは突然変異塩基の総数を配列32、36、37、38の塩基の総数で割って計算した。さらに、WT GCBCsの各JH4 PCR産物には1〜25個の変異が含まれていた(図5B)、1つの配列33、36に複数の突然変異が頻繁に見つかった。113AID-/-配列で同定された変異は2つだけである(図5A)。AID-/- B細胞は、WT B細胞(p<0.05)36より有意に低かった1.66 x10-5突然変異/bpを示し、高忠実度ポリメラーゼ(5.3 x 10-7サブ/ベース/倍増)51,52の誤差率と比較する。従って、AID-/-B細胞は、このアッセイに有用な陰性対照として役立った。 図1:CSRおよびSHM中の IgH 遺伝子遺伝子座及びAIDが標的とする領域の概略図赤色のバーは、VDJH4の3’の580 bp JH4イントロンを示し、このプロトコルで分析されます。CSRにおいて、イントロニックスイッチ領域(SμおよびSε)のAID依存的脱アミノ化は、欠失組換えおよび新しい抗体アイソタイプ(IgM〜IgE)の発現を可能にするDSB形成を促進する。SHMの間に、V領域(灰色の箱)は、より高い親和性Igにつながる可能性のある突然変異(青い線)を蓄積する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:Pから分離されたGCBCにおけるJH4イントロンのSHMを解析するワークフローこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3: PP GCBCs の特性(A) WTおよびAID-/-マウスからのPP細胞の総数 (n = 遺伝子型あたり 4)。 誤差範囲は平均からの標準偏差を表します。(B) WTおよびAID–マウスのPから得られたB220+PNAHI GCBCの割合(n =遺伝子型あたり4)36. エラー バーは、学生の t 検定を使用した平均 *p<0.05 からの標準偏差を表します。(C) 代表的な FACS プロットは、PPs から B220+PNAHI GCBCs を並べ替える.こちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。 図4:JH4サンガーシーケンスデータの解析(A)WT(上)およびAID-/-(下部)GCBCから参照ゲノムシーケンス(NG_005838)までのJH4 PCR産物のサンガー配列データのサンプル配列アライメント(NG_005838)は、番号付きティックマークのすぐ下のシーケンスである。 アライメントは、クルースカルオメガを使用して生成されました。(B)各ベースの異なるピークを表示した高品質のサンガーシーケンスデータのエレクトロフェログラム。(C)低品質のシーケンスデータの電解電解、曖昧なピークと不特定の塩基(N)を示した。赤で示されるヌクレオチドは、シーケンステキストファイル内で手動でアコード化する必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:WTおよびAID-/-GCBCsにおけるJH4イントロンにおける突然変異の解析(A)各遺伝子型のA、C、G、およびT塩基における遷移(赤)および転移(青)突然変異の総数を表に要約する。分析されたシーケンスの総数は、表の下に示されています。(B) 各遺伝子型のPCRアンプリコンあたりの突然変異数は円グラフに示されている。この図は、36著作権2020から変更されています。米国免疫学者協会は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 GCBCのための染色カクテル 容積:500 μL 抗体または色素 フルオロフォア 希釈 μL B220 PE 1000 0.5 ストレプトアビジン APC-eFluor780 500 1 ダピス 該当する 500 1 表1:GCBC用の染色カクテル 指定された希釈液で示された抗体または色素(イタリック体で示される)のカクテルを、フローサイトメトリー用に500μLのPP細胞を染色するために使用した。     補償のための単一の汚れ 容積:500 μL 抗体または色素 フルオロフォア 希釈 μL B220 PE 1000 0.5 B220 APC-eFluor780 750 0.67 ダピス 該当する 500 1 表2:補償のための単一の汚れコントロール。 示されたフルオロフォアに結合したB220抗体は、スペクトルの重複を補償するために単染色制御に使用した。     PCR #1 試薬 容積 サーモサイクラー条件 5x バッファ 4 μL 1 95°C 3分 10 mM dNTP 2 μL 2 94°C 30秒 10 μM J558FR3Fw 1 μL 3 55°C 30秒 10 μM VHJ558.2 1 μL 4 72°C 1:30分 高忠実度DNAポリメラーゼ 0.25 μL サイクル 2-4 9x デオキシリボ核酸 x (最も少ない濃縮サンプルに標準化) H2O 20 μLに 5 72°C 5分 PCR #2に進む前に、希薄PCR産物1:5 in H2O 表3:JH4イントロンのネストPCR 第1増幅反応に対するPCR成分およびサーモサイクラー条件。最初のPCR産物1:5を水で希釈し、この希釈液を1μLで2回目のPCRに使用します。     PCR #2 試薬 容積 サーモサイクラーの条件#2 5x バッファ 4 μL 1 94°C 3分 10 mM dNTP 2 μL 2 94°C 30秒 10 μM VHJ558.3 1 μL 3 55°C 30秒 10 μM VHJ558.4 1 μL 4 72°C 30秒 高忠実度DNAポリメラーゼ 0.25 μL サイクル 2-4 21x 希釈 PCR#1 1 μL H2O 20 μLに 5 72°C 5分 表4:第2PCRのPCR成分およびサーモサイクラー条件     試薬 容積 2x バッファ 10 μL 精製 PCR x (最も少ない濃縮サンプルに標準化) 鈍い端を持つプラスミド 1 μL T4 DNAリガーゼ 1 μL H2O 20 μLに 16ºCで5分間または一晩部屋の温度でインキュベート 表5:ライゲーション反応。 精製されたJH4イントロンPCR産物をプラスミドに結紮するための成分。     FACS バッファ 56°Cで使用前に1時間熱不活性化したFBS。サプリメントPBS、pH 7.4(ギブコ、#10010049)と熱不活化FBSの2.5%(v/v)4°Cで保管する。 DNA抽出バッファー (100 mM トリス pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.5% (w/v) SDS) 1 MトリスpH 8.0の50 mL、0.5 M EDTAの100mL、20%SDSの12.5 mLを加えます。蒸留水を500mLに加えます。室温で保管してください。 TE バッファ (10 mM トリス pH 8.0、1 mM EDTA) 1 M トリス pH 8.0 の 2.5 mL、0.5 M EDTA の 500 mL を加えます。蒸留水を250mLに加えます。室温で保管してください。 表 6: バッファレシピ     オリゴヌクレオチド一覧 J558FR3Fw 5′-GCCTGACATCTGAGGACTCTCTGC-3′ VHJ558.2 5′-CTGGACTTCGGTTGGG-3′ VHJ558.3 5′-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3′ VHJ558.4 5′-TCTCTAGACAGCAACTAC-3′ 表7:アッセイに用いられるオリゴヌクレオチド。     補足図1:ステップ5.4の完了後の代表的なアガロースゲル像。JH4イントロンネストPCR産物を1.5%アガロースゲルで分解し、580bpアンプリコンを切除した。WT PPは、WT PP GCBCゲノムDNAが最初のPCRの鋳型として使用されたことを示し、AID–PP GCBCゲノムDNAが最初のPCRの鋳型として使用されたことを示している。ɸは、PCRコントロールがないテンプレートを示し、-アガロースゲルのウェルに何もロードされなくなったを示します。最後の車線は100 bp DNAの梯子を示す。こちらをダウンロードしてください。