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Immunology and Infection

Analyse der somatischen Hypermutation im JH4-Intron von Keimzentrums-B-Zellen aus Maus Peyers Patches

Published: April 20, 2021
doi:
10.3791/61551
, , ,
1Department of Biology,The City College of New York and The Graduate Center of The City University of New York, 2Department of Microbiology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Hier wird ein Test zur Quantifizierung der somatischen Hypermutation innerhalb des Immunglobulin-Schweren-Ketten-Gen-Lokus mithilfe von Keimmittel-B-Zellen aus Denperas-Pflastern der Maus vorgestellt.

Abstract

Innerhalb der Keimzentren der Lymphorgane verändern reife B-Zellen ihr exprimiertes Immunglobulin (Ig) durch die Einführung untemplated Mutationen in die variablen kodierenden Exons des Ig schweren und leichten Kettengens loci. Dieser Prozess der somatische Hypermutation (SHM) erfordert das Enzym Aktivierung-induzierte Cytidin-Deaminase (AID), die Deoxycytidine (C) in Deoxyuridine (U) umwandelt. Durch die Verarbeitung der VON AID erzeugten U:G-Inkongruenzen in Mutationen durch die Basisexzision und Dieinkongruenz führt reparaturweise neue Ig-Codierungssequenzen ein, die eine höhere Affinität Ig erzeugen können. Mutationen in AID- oder DNA-Reparaturgenen können die in der Ig loci beobachteten Mutationen blockieren oder signifikant verändern. Wir beschreiben ein Protokoll zur Quantifizierung von JH4-Intronmutationen, das fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), PCR und Sanger-Sequenzierung verwendet. Obwohl dieser Test die Ig-Affinitätsreifung nicht direkt misst, ist er ein Hinweis auf Mutationen in Ig-Variablen-Codierungssequenzen. Darüber hinaus verwenden diese Methoden gängige molekularbiologische Techniken, die Mutationen in Ig-Sequenzen mehrerer B-Zellklone analysieren. Somit ist dieser Assay ein unschätzbares Instrument in der Untersuchung der SHM- und Ig-Diversifikation.

Introduction

B-Zellen, Mitglieder des adaptiven Immunsystems, erkennen und beseitigen Antigene durch die Produktion von Antikörpern, auch bekannt als Immunglobuline (Ig). Jede Ig besteht aus zwei schweren (IgH) und zwei leichten (IgL) Kettenpolypeptiden, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden, um die charakteristische “Y”-Formstruktur der Ig1zu bilden. Die N-termini von IgH und IgL bilden die Variable (V) jedes Polypeptids und bilden zusammen die Antigenbindungsstelle der Ig, während die konstante Region von IgH die Effektorfunktion des Ig vermittelt. Die Entwicklung von B-Zellen im Knochenmark ordnet die V-Kodierungsexons von IgH und IgL in einem Prozess neu an, der als V(D)J-Rekombination2,3,4” bekannt ist. Die Transkription der rekombinierten V-Exons, gekoppelt mit den jeweiligen konstanten Regionsexonen, bildet die mRNA, die in die Ig übersetzt wird.

Reife B-Zellen, die eine membrangebundene Ig exemiten, auch bekannt als B-Zell-Rezeptor (BCR), zirkulieren zu sekundären Lymphorganen, wie der Milz, dem Lymphknoten oder Peyers Flecken, wo sie die Umgebung für Antigene untersuchen und mit anderen Zellen des Immunsystems interagieren1. Innerhalb der Keimzentren (GC) der sekundären Lymphorgane werden B-Zellen aktiviert, die Antigen durch das BCR erkennen. Unterstützt von follikulären dendritischen Zellen und follikelischen Helfer-T-Zellen können sich dann aktivierte B-Zellen vermehren und in Plasma- und Gedächtniszellen differenzieren, die wichtige Effektoren einer robusten Immunantwort5,6,7,8,9sind. Zusätzlich können diese aktivierten B-Zellen sekundären Ig-Gen-Diversifikationsprozessen unterzogen werden – Klassenschalter-Rekombination (CSR) und somatische Hypermutation (SHM). Während der CSR tauschen B-Zellen den Standard-μ konstanten Bereich des IgH-Polypeptids durch eine DNA-Lösch-Rekombinationsreaktion(Abbildung 1) mit einer anderen konstanten Region (γ, α, ε) aus . Dies ermöglicht den Ausdruck einer anderen konstanten Exon und Übersetzung eines neuen Ig. Die B-Zelle wechselt von der Exdiniz von IgM zu einem anderen Isotyp (IgG, IgA, IgE). CSR ändert die Effektorfunktion der Ig, ohne ihre Antigenspezifität10,11,12zu verändern. Während des SHM mutieren B-Zellen jedoch die V-Kodierungsbereiche von IgH und IgL, um die Produktion und Auswahl von Igs mit höherer Affinität zu ermöglichen, die ein Antigen13,14,15 ( Abbildung1) effektiver eliminieren können. Wichtig ist, dass sowohl CSR als auch SHM von der Funktion eines Enzyms abhängen: Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID)16,17,18. Menschen und Mäuse mit einem Mangel an AID können CSR oder SHM nicht abschließen und mit erhöhten IgM-Serum-Tistern oder Hyper-IgM17,19präsentieren.

In CSR deaminiert AID Deoxycytidine (C) in den sich wiederholenden Schaltbereichen, die jeder konstanten Codierung vorausgehen, und wandelt sie in Deoxyuridine (U)20,21um, wodurch eine nicht übereinstimmende Basenpaarung zwischen Desoxyuridinen und Desoxyguanosinen (U:G) entsteht. die für die DNA-Rekombination erforderlich sind, entweder durch die Basisexzisionsreparatur (BER) oder die Mismatch-Reparatur (MMR) Weg22,23,24,25,26,27,28,29. In SHM deaminiert AID C innerhalb der V-Kodierungsexons. Die Replikation über das U:G-Inverhältnis erzeugt C:G bis T:A-Übergangsmutationen, während die Entfernung der Uracil-Basis durch das BER-Protein Uracil DNA Glycosylase (UNG) vor der DNA-Replikation sowohl Übergangs- als auch Transversionsmutationen erzeugt16. Nullmutationen in UNG erhöhen C:G bis T:A Übergangsmutationen21,22. Ähnlich wie CSR benötigt SHM die ergänzenden Rollen von MMR und BER. Während SHM erzeugt MMR Mutationen bei A:T-Basispaaren. Die Inaktivierung von Mutationen in MutS homology 2 (MSH2) oder DNA-Polymerase η (Pol )reduziert signifikant Mutationen an A:T-Basen und zusammengesetzte Mutationen in MSH2 und Pola beseitigt praktisch Mutationen an den A:T-Basen21,30,31. In Übereinstimmung mit der kritischen Rolle für BER und MMR bei der Umwandlung von AID-generierten U in Übergangs- oder Transversionsmutationen zeigen Mäuse, die sowohl mSH2 als auch UNG(MSH2-/-UNG-/-) schwächen, nur C:G zu T:A-Übergangsmutationen an, die sich aus der Replikation über das U:G-Missverhältnis21ergeben.

Die Analyse von SHM in V-Kodierungsregionen bleibt kompliziert, da die Entwicklung von B-Zellen alle V(D)J-Kodierungsexons in den IgH- und IgL-Loci 1,2,4rekombinieren kann. Eine genaue Analyse dieser einzigartig rekombinierten und somatical mutierten V-Regionen erfordert die Identifizierung und Isolierung von Klonen von B-Zellen oder der Ig mRNA11,13. Das JH4-Intron, das 3′ des letzten J-Kodierungsexons im IgH-Lokus ist, birgt somatische Mutationen aufgrund der Ausbreitung von Mutationen 3′ des V-Promotors32,33,34 und wird daher häufig als Ersatzmarker für SHM in den V-Regionen31,35 ( Abbildung1)verwendet. Um experimentell aufzuklären, wie bestimmte Gene oder genetische Mutationen SHM-Muster oder -Raten verändern, kann das JH4-Intron aus Peyers Patches (PP) Keimmittel-B-Zellen (GCBCs) sequenziert werden, die hohen Raten von SHM36,37,38unterliegen. GCBCs können leicht identifiziert und mit fluoreszierend konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker (B220+PNAHI)17,39isoliert werden.

Ein detailliertes Protokoll wird vorgestellt, um JH4-Intronmutationen in PP-GCBCs von Mäusen unter Verwendung einer Kombination aus FACS (Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung), PCR und Sanger-Sequenzierung (Abbildung 2) zu charakterisieren.

Protocol

Alle mutierten Mäuse wurden auf einem C57BL/6-Hintergrund gehalten. Für alle Experimente wurden altersgerechte (2-5 Monate alte) männliche und weibliche Mäuse verwendet. Die Vermehrung und Die Experimente mit Mäusen wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden. 1. Zerlegung von Peyers Pflastern Euthanisieren Sie die Maus mit 100%CO2 bei 3 L/min für 5 min, gefolgt von zervikaler Dislokation, um den Tod zu bestätigen. Sterilisieren Sie Sezierwerkzeuge (Schere, Zange, feine Zange) und Handschuhe mit 70% Ethanol. Legen Sie die Maus auf das Sezierpad mit dem Abdomen ausgesetzt. Sprühen Sie den Körper der Maus großzügig mit 70% Ethanol, bevor Sie IrgendwelcheSchnitte machen, um den Sezierenbereich zu sterilisieren. Machen Sie einen Schnitt in die Haut über den Bauch und entfernen Sie die Haut aus dem Bauch, indem Sie gleichzeitig auf beiden Seiten des Schnittes in Richtung Kopf und Schwanz mit Zangen (oder sterilisierten, gehandicapten Händen) ziehen. Pin down die Vorder- und Hinterbeine der Maus. Schneiden Sie die Peritonealhöhle mit einer Schere, um die inneren Organe freizulegen. Suchen Sie den Dünndarm zwischen Magen und Caecum (“J” geformte Struktur in der Nähe des Dickdarms). Entfernen Sie den Dünndarm, indem Sie unter dem Magen und über dem Caecum schneiden. Entfernen Sie alle Bindegewebe und Fett verbinden die Falten des Dünndarms zusammen.HINWEIS: Fett wird eine unverwechselbare weiße Farbe haben, im Gegensatz zu der rosa Farbe des Dünndarms. Untersuchen Sie die außenoberfläche des Dünndarms auf die Peyer-Pflaster (PPs), die klein sind (ca. 1 mm), ovale Strukturen, die unter einer dünnen Schicht von transluzenten Epithelzellen weiß erscheinen. Sorgfältig alle sichtbaren PP mit Schere verbrauchen.HINWEIS: Eine C57BL/6 Wildtyp (WT) Maus kann 4-8 PPs ergeben, während eine AID-/- Maus 6-10 PPs hat. Sammeln Sie die PPs in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 1 ml FACS-Puffer auf Eis enthält.HINWEIS: Das PP sollte sinken, während Fett an die Oberfläche schwebt und entfernt werden kann. 2. Zellisolierung für FACS Legen Sie einen 40-mm-Filter in eine 6-Well-Schale mit 1 ml kaltem (4 °C) FACS-Puffer. Gießen Sie die PPs aus dem 1,5 ml Rohr auf den Filter. Waschen Sie PPs mit 1 ml kalten FACS-Puffer, um sicherzustellen, dass sie immer in Flüssigkeit und auf Eis sind. Verwenden Sie das flache Ende des Kolbens aus einer 1 ml Spritze als Stößel, um die PPs am Filter zu zerkleinern, bis nur noch Bindegewebe auf dem Filter verbleibt. Waschen Sie den Filter und Kolben mit 1 ml kalten FACS Puffer, um die Zellen in die 6 Brunnenschale freizugeben. Sammeln Sie die 4 ml Zellen im kalten FACS-Puffer und filtern Sie sie durch eine 40-m-Siebkappe FACS-Röhre. Waschen Sie die Siebkappe mit 1 ml kaltem FACS-Puffer. Pellet die Zellen bei 600 x g bei 4 °C für 5 min in einer schwingenden Eimerzentrifuge. Dekant den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 0,4 ml kaltem FACS-Puffer wieder aus. Entfernen Sie 10 L für die Zellzählung, um die Ausbeute zu überprüfen (erwarten Sie 5 x 106 Zellen/Maus, siehe Abbildung 3A) Filtern Sie die verbleibenden Zellen durch eine 40-mm-Siebkappe in ein FACS-Rohr und fahren Sie mit der Färbung für FACS fort. 3. Färbung gcBCs für FACS Fügen Sie der 400-L-Zellsuspension einen Block von 1 L Fc (unbeschriftete Anti-Maus-CD16/CD32) hinzu und legen Sie die Zellen 15 min auf Eis. Fügen Sie 2 ml kalten FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen. Pelletzellen bei 600 x g bei 4 °C für 5 min und den Überstand entsorgen. Setzen Sie die Zellen in 80 L kalten FACS-Puffer aus. Entfernen Sie 10 L Zellen aus dem WT PP für jede Färbekontrolle (insgesamt 4, einschließlich 3 Einzelfleckenkontrollen und 1 ungefärbte Kontrolle). Lassen Sie 40 L des WT PP für den nächsten Schritt. Alternativ können Sie Kompensationsperlen für die Färbekontrollen verwenden. Färben Sie jede der experimentellen Proben (z.B. WT und AID-/-) in 500 l kalten FACS-Puffer mit 2,5 l Erdnussagglutinin (PNA)-Biotin für 15 min auf Eis. Fügen Sie 2 ml kalten FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen. Pelletzellen bei 600 x g bei 4 °C für 5 min und den Überstand entsorgen. Färben Sie jede Versuchsprobe mit 500 l des Cocktails im Dunkeln, auf Eis, für 15 min (Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig im Färbecocktail resuspendiert sind. Bereiten Sie einzelne Fleckenkontrollen für die Kompensationsmatrix vor. Färben Sie die Zellen in 500 l kalten FACS-Puffer mit den in Tabelle 2angegebenen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Färbung Kontrollen im Dunkeln, auf Eis, für 15 min. Fügen Sie 2 ml kalten FACS-Puffer in alle Rohre in den Schritten 3.7 und 3.8, Pellet der Zellen, und entsorgen Sie den Überstand, um ungebundene Antikörper oder DAPI abzuwaschen. Setzen Sie die Zellen in 500 l kalten FACS-Puffer aus und legen Sie sie auf Eis. Sammeln Sie mit einem Zellsortierer B220+PNAHI aus jeder gebeizten Versuchsprobe. Abbildung 3B zeigt die typischen Prozentsätze von B220+ PNAHI aus WT und AID-/- PPs. Abbildung 3C zeigt die FACS-Gating-Strategie. 4. DNA-Extraktion aus GCBCs Pellet sortierte Zellen bei 600 x g bei 4 °C für 5 min und verwerfen den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 1 ml kalten FACS-Puffer wieder auf und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Pellet die Zellen bei 600 x g bei 4 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 500 l DNA-Extraktionspuffer und 5 l mit 20 mg/ml Proteinase K aus. Bei 56 °C über Nacht inkubieren. Niederschlagen Sie DIE DNA mit 500 l Isopropanol und 1 l mit 20 mg/ml Glykogen. Mischen Sie das Rohr gründlich, indem Sie 5-6x invertieren. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge für 15 min bei 25 °C bei 21.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das Pellet, das die gefällte DNA und Das Glykogen enthält. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol. Pellet die DNA in einer Mikrozentrifuge für 10 min bei 25 °C bei 21.000 x g. Entfernen Sie das 70% Ethanol und trocknen Sie das DNA-Pellet für 5-10 min.HINWEIS: Vermeiden Sie Eine Übertrocknung, da die DNA möglicherweise nicht vollständig rehydriert. Setzen Sie die DNA in einem 30-L-TE-Puffer aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 56 °C. 5. JH4-Intronsequenzverstärkung und -analyse Quantifizieren Sie die DNA, indem Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (A260) messen.HINWEIS: Die typische Konzentration der DNA, die aus sortierten B220+PNAHI GCBCs einer C57BL/6-Maus gewonnen wird, beträgt 20-40 ng/l. Führen Sie die verschachtelte PCR für das JH4 intron (Tabelle 3, Tabelle 4) aus. Normalisieren Sie die Gesamtmenge der genomischen DNA, die in der ersten PCR verwendet wird, auf die am wenigsten konzentrierte Probe. (z. B. wenn die am wenigsten konzentrierte Probe 5 ng/l beträgt, verwenden Sie 58,75 ng DNA für alle Proben im maximalen Wasservolumen (11,75 l) in PCR-#1). Lösen Sie das PCR-Produkt auf einem 1,5% Agarose-Gel bei 200 V für 20 min. Die erwartete Amplicongröße beträgt 580 bp. Verbrauchen Sie das Amplicon aus dem Gel und extrahieren Sie die DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Ergänzende Abbildung 1). Elute die DNA mit 30 l Wasser und quantifizieren Sie die Menge der DNA durch Messung der A260.HINWEIS: Die typische Konzentration des gereinigten PCR-Produkts beträgt 3-10 ng/l. Ligate das gereinigte PCR-Produkt in ein Plasmid mit stumpfen Enden. Standardisieren Sie die Gesamtmenge des PCR-Produkts, das in jeder Ligationsreaktion verwendet wird (Tabelle 5). Inkubieren Sie die Ligationsreaktion bei Raumtemperatur für 5 min oder über Nacht bei 16 °C. Transformieren Sie elektrokompetente Bakterienzellen mit 2 L der Ligationsreaktion. Elektropolat bei 1,65 kV. Rettung in 600 l SOC-Medien für 1 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 225 R/min. Platte 100 l transformierte Bakterien auf LB, ergänzt mit Ampicillin (100 g/ml) Agarplatten und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Reichen Sie die Platte der bakteriellen Kolonien für Sanger-Sequenzierung mit der T7 Vorwärtsprimer. Alternativ können Sie über Nacht Kulturen jeder Bakterienkolonie wachsen und eine Plasmidreinigung durchführen. Wiederholen Sie ggf. die PCR,Ligation und/oder Transformation, um die Ausbeute von Bakterienkolonien zu optimierenHINWEIS: Von jeder Platte sollten mindestens 30 Kolonien gepflückt werden. Standardisieren der Sequenzdaten in den .txt Dateien Löschen Sie die Plasmidsequenz. Stellen Sie sicher, dass jede Sequenz 5′ bis 3′ gemäß der JH4-Intron-Referenzsequenz (NG_005838) ausgerichtet ist. Generieren Sie bei Bedarf die umgekehrte Komplementmenge einer beliebigen Sequenz. Richten Sie die für jede PCR erhaltenen Sequenzen mit einer Clustal Omega Software(Abbildung 4A) an der JH4-Intron-Referenzsequenz (NG_005838) aus. Identifizieren von Unterschieden zur Referenzsequenz als Mutationen Stellen Sie sicher, dass alle Mutationen wahre Punktmutationen sind, indem Sie das Elektropherogramm der Sanger-Sequenzierung untersuchen. Wiederholen Sie ggf. die Sequenzierung. (Abbildung 4B,C). Tabellierung und Quantifizierung einzigartiger Mutationen im JH4-Intron für jeden Genotyp (Abbildung 5). Zählsequenzen mit identischen Mutationen nur einmalHINWEIS: Es ist nicht möglich festzustellen, ob die identischen Sequenzen während der PCR oder identische SHM-Ereignisse in verschiedenen B-Zellen erzeugt wurden. Zählen Sie jede Instanz der WT-Keimbahn JH4-Intronsequenzen (d. h. solche ohne Mutationen) als eindeutige Sequenz.

Representative Results

DurchflusszytometrieReife B-Zellen zirkulieren zu Keimzentren, wo sie Affinitätsreifung, Klonexpansion und Differenzierung in Plasma- oder Gedächtniszellen40,41,42,43,44. Diese GCBCs können durch zahlreiche Zelloberflächenmarker identifiziert werden, einschließlich einer hohen Expression des CD45R/B220-Rezeptors und der Bindung von Erdnussagglutinin (PNA)45,46. Um aktivierte GCBCs zu isolieren, wurden PP-Zellen mit Anti-B220-Antikörpern verfärbt, die mit Phycoerythrin (PE) und biotinylatierter PNA konjugiert wurden, gefolgt von Streptavidin, konjugiert mit APC-eFluor780. Abgestorbene Zellen wurden mit dem fluoreszierenden 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Farbstoff eliminiert, der die Nukleinsäure von sterbenden oder abgestorbenen Zellen47,48färbt. Die gefärbten Zellen wurden anschließend analysiert und mittels Durchflusszytometrie sortiert. Die PPs bestanden aus 80% B220+ Zellen49,50. WT PPs enthalten durchschnittlich 4 x 106 Zellen pro Maus (Abbildung 3A). Ungefähr 8% der WT PP-Zellen waren B220+PNAHI, das ist die Hälfte der Zahl, die in AID-/ – beobachtet wurde ( Abbildung3B). So wurden nach der Sortierung 0,3-0,6 x 106 B220+PNAHI GCBCs erhalten, die ausreichten, um Mutationen im JH4-Intron zu analysieren. JH4 SequenzanalyseDas JH4-Intron wurde durch eine verschachtelte PCR mit gängigen VHJ558-Familienprimern (J558FR3Fw und VHJ558.2) verstärkt, gefolgt von JH4-Intron-Spanngrundierungen VHJ558.3 und VHJ558.435,37. Von den 105 einzigartigen Sequenzen, die aus WT GCBCs gewonnen wurden, wurden insgesamt 226 Mutationen gefunden (Abbildung 5A). Die Analyse des GCBC-Mutationsspektrums bei den WT-Mäusen zeigte eine Reihe von Übergängen und Transversionen mit einer Rate von 4 x 10-3 Mutationen/bp, die berechnet wurde, indem die Gesamtzahl der mutierten Basen durch die Gesamtzahl der Basen dividiert wurde, die32,36,37,38sequenziert wurden. Zusätzlich enthielt jedes JH4 PCR-Produkt aus WT GCBCs 1-25 Mutationen (Abbildung 5B), wobei mehrere Mutationen häufig auf einer Sequenz gefunden wurden33,36. Nur zwei Mutationen wurden in 113 AID-/- Sequenzen identifiziert (Abbildung 5A). AID-/- B-Zellen wiesen 1,66 x 10-5 Mutationen/bp auf, die signifikant niedriger waren als WT B-Zellen (p <0.05)36 und im Vergleich zur Fehlerrate der Hochtreuepolymerase (5,3 x 10-7 sub/base/double)51,52. Daher dienten AID-/- B-Zellen als nützliche Negative Kontrolle für diesen Test. Abbildung 1: Schematische simonische Lage des IgH-Genortes und der von AID während CSR und SHM ins Visier genommenen Regionen. Der rote Balken zeigt das 580 bp JH4 intron an, das 3′ von VDJH4-Umlagerungen ist und in diesem Protokoll analysiert wird. In CSR fördert die AID-abhängige Deamination intronischer Schaltbereiche (S- und S)-Bildung die DSB-Bildung, die eine Deletional-Rekombination und die Expression eines neuen Antikörper-Isotyps (IgM zu IgE) ermöglicht. Während SHM akkumulieren V-Regionen (graue Felder) Mutationen (blaue Linien), die zu einer höheren Affinität Ig führen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Workflow zur Analyse von SHM des JH4-Introns in GCBCs, die von PPs isoliert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Charakterisierung von PP-GCBCs. (A) Gesamtzahl der PP-Zellen von WT und AID-/- Mäusen (n = 4 pro Genotyp). Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung vom Mittelwert dar. (B) Prozentsatz der B220+PNAHI GCBCs aus PPs von WT und AID-/- Mäusen (n = 4 pro Genotyp)36. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung vom Mittelwert *p<0.05 mithilfe des t-Tests des Schülers dar. (C) Repräsentative FACS-Plots, um B220+PNAHI GCBCs von PPs zu sortieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Analyse der JH4 Sanger-Sequenzdaten. (A) Beispielsequenzausrichtungen der Sanger-Sequenzdaten des JH4 PCR-Produkts von WT (oben) und AID-/- (unten) GCBCs zur Referenzgenomsequenz (NG_005838), d. h. der Sequenz unmittelbar unterhalb der nummerierten Teilstriche. Mit Clustal Omega wurden Ausrichtungen erzeugt. (B) Elektropherogramm hochwertiger Sanger-Sequenzdaten, die für jede Basis unterschiedliche Spitzen zeigten. (C) Elektropherogramm von Sequenzdaten niedriger Qualität, die mehrdeutige Spitzen und nicht spezifizierte Basen (N) zeigten. Das rot dargestellte Nukleotid muss in der Sequenztextdatei manuell mit Anmerkungen angezeigt werden.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Analyse von Mutationen im JH4-Intron in WT und AID-/- GCBCs. (A) Die Gesamtzahl der Übergangsmutationen (rot) und transversion (blau) an den A-, C-, G- und T-Basen für jeden Genotyp ist in den Tabellen zusammengefasst. Die Gesamtzahl der analysierten Sequenzen wird unterhalb der Tabelle angegeben. (B) Die Anzahl der Mutationen pro PCR-Amplikon für jeden Genotyp wird in den Kreisdiagrammen dargestellt. Diese Zahl wurde von Choi et al.36 Copyright 2020 geändert. Die American Association of Immunologists, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Staining Cocktail für GCBCs Volumen: 500 l Antikörper oder Farbstoff Fluorophor Verdünnung Μl B220 Pe 1000 0.5 Streptavidin APC-eFluor780 500 1 Dapi N/A 500 1 Tabelle 1: Färbende Cocktails für GCBCs. Cocktail der angegebenen Antikörper oder Farbstoffe (in Kursivschrift) an den angegebenen Verdünnungen wurden verwendet, um PP-Zellen in 500 l für Diedurchflusszytometrie zu färben.     Einzelne Flecken für entschädigungsgeforciert Volumen: 500 l Antikörper oder Farbstoff Fluorophor Verdünnung Μl B220 Pe 1000 0.5 B220 APC-eFluor780 750 0.67 Dapi N/A 500 1 Tabelle 2: Einheitliche Fleckenkontrollen zur Kompensation. B220-Antikörper, die mit den angegebenen Fluorophoren konjugiert wurden, wurden für einzelne Fleckenkontrollen verwendet, um spektrale Überlappungen auszugleichen.     PCR-#1 Reagenz Volumen Thermocycler-Bedingungen 5x Puffer 4 l 1 95 °C 3 Min. 10 mM dNTP 2 l 2 94 °C 30 Sek. 10 M J558FR3Fw 1 L 3 55 °C 30 Sek. 10 m VHJ558,2 1 L 4 72 °C 1:30 min High Fidelity DNA-Polymerase 0,25 l Zyklus 2-4 9x Dna x (Standardisierung auf am wenigsten konzentrierte Probe) H2O bis zu 20 l 5 72 °C 5 Min. PCR-Produkt 1:5 inH2O verdünnen, bevor Sie mit PCR-#2 Tabelle 3: Verschachtelte PCR des JH4-Introns. PCR-Komponenten und Thermocycler-Bedingungen für die erste Amplifikationsreaktion. Verdünnen Sie das erste PCR-Produkt 1:5 mit Wasser und verwenden Sie 1 l dieser Verdünnung für die zweite PCR.     PCR-#2 Reagenz Volumen Thermocycler-Bedingungen #2 5x Puffer 4 l 1 94 °C 3 Min. 10 mM dNTP 2 l 2 94 °C 30 Sek. 10 m VHJ558,3 1 L 3 55 °C 30 Sek. 10 m VHJ558,4 1 L 4 72 °C 30 Sek. High Fidelity DNA-Polymerase 0,25 l Zyklus 2-4 21x Verdünnte PCR-Nr. 1 1 L H2O bis zu 20 l 5 72 °C 5 Min. Tabelle 4: PCR-Komponenten und Thermocycler-Bedingungen für die zweite PCR.     Reagenz Volumen 2x Puffer 10 l Gereinigte PCR x (Standardisierung auf am wenigsten konzentrierte Probe) Plasmid mit stumpfen Enden 1 L T4 DNA Ligase 1 L H2O bis zu 20 l Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min oder Übernachtung bei 16oC Tabelle 5: Ligationsreaktion. Komponenten für die Ligation des gereinigten JH4-Intron-PCR-Produkts in das Plasmid.     FACS-Puffer Inaktivieren Sie FBS bei 56 °C eine Stunde vor Gebrauch. Ergänzung PBS, pH 7,4 (Gibco, #10010049) mit 2,5% (v/v) wärmeinaktiviertem FBS. Bei 4°C lagern. DNA-Extraktionspuffer (100 mM Tris pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS) Fügen Sie 50 ml von 1 M Tris pH 8,0, 100 ml von 0,5 M EDTA und 12,5 ml von 20% SDS hinzu. Destilliertes Wasser auf 500 ml anbringen. Bei Raumtemperatur aufbewahren. TE Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) 2,5 ml von 1 M Tris pH 8,0 und 500 ml mit 0,5 M EDTA hinzufügen. Destilliertes Wasser auf 250 ml anbringen. Bei Raumtemperatur aufbewahren. Tabelle 6: Pufferrezepte.     Oligonukleotide Liste J558FR3Fw 5′-GCCTGACTCTGAGGACTCTGC-3′ VHJ558,2 5′-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3′ VHJ558,3 5′-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3′ VHJ558,4 5′-TCTCTAGACAGCAACTAC-3′ Tabelle 7: Oligonukleotide, die im Test verwendet werden.     Ergänzende Abbildung 1: Repräsentatives Agarose-Gelbild nach Abschluss von Schritt 5.4. Das JH4 intron verschachtelte PCR-Produkt wurde auf einem 1,5% Agarose-Gel aufgelöst und das 580 bp Amplicon wurde ausgeschnitten. WT PP gibt an, dass WT PP GCBC genomische DNA als Vorlage für die erste PCR verwendet wurde und AID PP zeigt an, dass AID-/- PP GCBC genomische DNA als Vorlage für die erste PCR verwendet wurde. ɸ zeigt die PCR-Steuerung ohne Vorlage an und – zeigt an, dass nichts in den Brunnen des Agarose-Gels geladen wurde. Die letzte Spur zeigt eine 100 bp DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Discussion

Die Charakterisierung von SHM innerhalb der IgH- und IgL-V-Codierungssequenzen einer heterogenen B-Zellpopulation stellt eine Herausforderung dar, da jede B-Zelle V-Kodierungssegmente während der V(D)J-Rekombination 34eindeutig neu organisiert. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Mutationen im JH4-Intron von GCBCs. Das JH4-Intron, das sich 3′ des letzten J-Kodierungssegments im IgH-Lokus befindet, wird als Ersatz für SHM von V-Regionen verwendet (Abbildung 1)31,33,34,35. Um diese JH4-Intronmutationen zu katalogisieren und zu beurteilen, wie bestimmte Gene die Produktion oder das Muster von Mutationen beeinflussen, werden PP-GCBCs speziell analysiert. Diese Zellen akkumulieren JH4-Intronmutationen als Folge der chronischen Stimulation durch Darmmikrobiota53. Darüber hinaus haben die B220+PNAHI GCBCs aus den PPs von nicht immunisierten Mäusen ein Mutationsspektren, das mit splenischen GCBCs von immunisierten Tieren54,55verglichen wird. Mutationen im JH4-Intron können jedoch nicht mit der Ig-Affinitätsreifung korreliert werden, da diese Mutationen nicht kodieren.

Um festzustellen, ob SHM die Ig-Affinität verändert, sollten Mäuse intraperitoneal mit einem Antigen wie NP (4-Hydroxy-3-Nitrophenylacetyl) konjugiert mit CGG (Huhn-Gamma-Globulin) oder KLH (Keyhole limpet Hämocyanin)56immunisiert werden. Anschließend kann mRNA aus splenic B220+PNAHI GCBCs gereinigt werden, um SHM innerhalb von VH186.2 zu untersuchen, das V-Kodierungsexon, das NP am häufigsten erkennt und nach NP-CGG- oder NP-KLH-Immunisierung31,57,58,59,60mutiert ist. Mutation von Tryptophan-33 zu einem Leucin in VH186.2 wurde charakterisiert, um die Ig-Affinität bis zu 10-fach59,60 zu erhöhen und ist daher ein Indikator dafür, dass SHM und klonale Selektion eine hohe Affinität Ig erzeugt hat. Die Messung von NP7- und NP20-spezifischen Serum-Ig-Titern durch ELISA und die Berechnung des Ig-spezifischen NP7/NP20-Verhältnisses im Verlauf der Immunisierung dokumentiert auch die Ig-Affinitätsreifung aus SHM der V-Regionen17,21,36. Beide Assays können verwendet werden, um SHM innerhalb der VH186.2-Codierungssequenzen mit Veränderungen der NP-spezifischen Ig-Affinitätsreifung zu korrelieren.

Unabhängig davon, ob immunisierte oder nicht immunisierte Tiere zur Analyse von SHM von VH186.2 oder dem JH4-Intron verwendet werden, müssen GCBCs genau identifiziert werden. Wir präsentieren einen FACS-basierten Ansatz zur Isolierung von B220+PNAHI GCBCs. Alternativ können fas und nicht sulfatiertes Antigen mit 2-6-Sialyl-LacNAc, das durch den GL7-Antikörper61,62,63,64erkannt wird, auch zur Isolierung von GCBCs verwendet werden, die als B220+Fas+GL7+65 oder CD19+Fas+GL7+37identifiziert sind. Die GL7-Expression spiegelt PNA in aktivierten GCBCs der Lymphknoten64,65,66. Neben der Verwendung von Antikörpermarkern speziell für GCBCs sollten Färbecocktails die Anregung eines Fluorophors und den Nachweis eines Biomarkers maximieren und gleichzeitig die spektrale Überlappung der Fluoreszenzemission minimieren. Antigene, die in niedrigen Konzentrationen exprimiert werden, sollten mit einem Antikörper nachgewiesen werden, der mit einem Fluorophor mit einer robusten Emissionsfluoreszenz67konjugiert ist. Das empfohlene Färbeprotokoll wurde für die Analyse eines Zellsortierers optimiert, der mit vier Lasern (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) und 12 Filtern ausgestattet ist; Filterkonfigurationen und Laserverfügbarkeit variieren jedoch zwischen den Zytometern. Um das Protokoll nach Reagenz und Geräteverfügbarkeit zu ändern, wird der Leser auf zusätzliche Ressourcen, Online-Spektrum-Viewer und veröffentlichte Literatur67,68,69,70,71,72,73verwiesen. Das hier beschriebene mehrfarbige Färbeprotokoll erfordert eine Kompensation der spektralen Überlappung, um sicherzustellen, dass die sortierten Zellpopulationen GCBCs sind, anstatt eine ungenaue Detektion der Fluoreszenzemission. B220 dient als nützliche Färbekontrolle für die beschriebene FACS (Tabelle 1B), da PPs ausgeprägte B220-negative und positive Populationen aufweisen werden (Abbildung 3C), was eine angemessene Kompensation der spektralen Überlappung ermöglicht. Die in Abbildung 3C dargestellte Gating-Strategie sollte als Richtschnur dienen. Die Strömungszytometrie-Plots können je nach Färbebedingungen und Zytometereinstellungen variieren. Dennoch sollten 4-10% der lebenden Zellen B220+PNAHI 35, 52sein.

Alle Mutationen innerhalb des JH4-Introns von PP-GCBCs müssen validiert werden, um sicherzustellen, dass die beobachteten Mutationen wirklich sHM reflektieren und kein Artefakt der PCR oder Sequenzierung. AID-/- B-Zellen können als nützliche negativkontrollierbare Untersuchung des SHM-Phänotyps in anderen mutierten Mausmodellen dienen, da diese Zellen SHM17,19nicht abschließen können. Die JH4-Intronmutationsrate in der von AID-/- GCBCs (1.66×10-5 Mutationen/bp)20,21,36,37,38,50,74 ist vergleichbar mit der Fehlerrate der Hochtreuepolymerase (5.3×10-7 sub/base/doubling)51,52, die zur Verstärkung der DNA in der verschachtelten PCR verwendet wird. Wenn AID-/- Mäuse nicht verfügbar sind, vergleichen Sie das beobachtete Mutationsmuster und die Beobachtete Häufigkeit mit der veröffentlichten Literatur. Ig-V-Regionen akkumulieren 10-3-10-4 Mutationen pro Basispaarteilung, was etwa 106-malhöher ist als die Mutationsrate anderer Gen-Loci73,75. Die Ergebnisse können mit dem Alter des Tieresvariieren 76. Alternativ können B220+PNA-LO-Zellen, die Nicht-GCBCs kennzeichnet, als Negativkontrolle verwendet werden, wenn AID -/- Mäuse52fehlen. Wenn die Mutationshäufigkeit in WT GCBCs niedriger ist als erwartet, kann die WT-Keimbahn JH4 intronische Sequenz überproportional dargestellt werden. Stellen Sie in diesem Fall sicher, dass GCBCs entsprechend gebeizt und sortiert wurden und PCRs frei von WT-Keimbahn JH4-Intronkontamination sind. Darüber hinaus sollten rohen Sequenzierungsdaten in Elektropherogrammen gründlich analysiert werden, um sicherzustellen, dass Mutationen in den Sequenztextdaten keine Artefakte von Sequenzierungsfehlern sind. Beispielsweise können schlechte Sanger-Sequenzierungsergebnisse die Zuverlässigkeit der Sequenzdaten verringern (Abbildung 4). Diese Qualitätskontrolle der Sanger-Sequenzdaten erhöht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der JH4-Intronmutationsanalyse.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Tasuku Honjo für die AID-/- Mäuse. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Minority Health and Health Disparities (5G12MD007603), The National Cancer Institute (2U54CA132378) und dem National Institute of General Medical Sciences (1SC1GM132035-01) unterstützt.

Materials

0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed USA Scientific 1402-4708
Ampicillin sodium salt Fisher BP1760-5
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 eBioscience 47-0452-80 clone RA3-6B2
BD FACSAria II BD 643186 four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50),
AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40),
PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))
BD slip tip 1mL syringe Fisher 14-823-434 sterile
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) Vector Labs B-1075-5
C57BL/6J mice Jackson Laboratories 664
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap Fisher 08-771-23
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) Fisher D1306 0.5 mg/ml
dNTP NEB N0447L 10 mM
ElectroMAX DH10B competent cells Fisher 18-290-015
Falcon cell strainer 40mm Fisher 08-771-1
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) Fisher 14-959-5
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) Fisher 149591A
Fetal bovine serum R&D Systems (Atlanta Biologicals) S11150
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 Fisher 10-010-049
Glycogen Sigma 10901393001
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) DNA Star version 15
PE anti-CD45R/B220 BD 553090 clone RA3-6B2
Proteinase K Fisher BP1700-100
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate eBioscience 47-4317-82
T4 DNA ligase NEB M020L
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher FERK1231
Tissue culture plate 6 well Fisher 08-772-1B sterile
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD Fisher BDB553142 Clone 2.4G2
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Sible, E., Zheng, S., Choi, J. E., Vuong, B. Q. Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer’s Patches. J. Vis. Exp. (170), e61551, doi:10.3791/61551 (2021).
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