Driedimensionale motorische zenuw organoïde generatie

1. SU-8 malfabricage door fotolithografie OPMERKING: Deze procedure heeft betrekking op gevaarlijke chemische stoffen. Gebruik overal een afzuigkap en PBM. Reinig de siliciumwafel (4-inch in diameter, 1 mm dikte, gepolijst) met aceton en blaas met stikstofgas. Bak vervolgens op 180 °C gedurende 3 minuten om te drogen. Doseer 3 ml SU-8 2100 op een gereinigd wafeltje. Bedek de SU-8 gelijkmatig op de wafer met behulp van een spincoater bij 500 tpm gedurende 10 s en draai vervolgens opeenvolgend bij 1500 tpm gedurende 30 s met een versnelling van 300 tpm/s om een 150 μm dikke laag SU-8 te verkrijgen.OPMERKING: Zorg ervoor dat de siliconen wafer in het midden van de spincoater is geplaatst en correct door vacuüm is bevestigd. Bak de wafel zachtjes op de kookplaat op 50 °C gedurende 10 minuten, op 65 °C gedurende 7 minuten en op 95 °C gedurende 45 min. Stel het fotomasker (figuur 1) in op de maskeruitlijner en stel UV-licht (365 nm) gedurende 60 s bloot.OPMERKING: De blootstellingstijd moet worden geoptimaliseerd door een geschikte dosis UV-licht. Bak de wafer na blootstelling gedurende 6 minuten op 65 °C en gedurende 13 minuten op 95 °C op de kookplaat. Ontwikkel de wafer gedurende 10-20 minuten in SU-8-ontwikkelaar met agitatie met behulp van een orbitale shaker, waarbij de ontwikkelende oplossing eenmaal tijdens het proces wordt gewijzigd.OPMERKING: Verleng de ontwikkeltijd wanneer het vuil van SU-8 achterblijft. Spoel de wafer af in isopropanol en droog de wafel voorzichtig af met stikstofgas. Meet de hoogte van de afgezette SU-8 met een meetmicroscoop en zorg ervoor dat deze ongeveer 150 μm dik is. Het kan voor onbepaalde tijd worden bewaard bij kamertemperatuur. 2. PDMS microfluïdische weefselcultuur chip fabricage Bevestig de SU-8-gedeponeerde wafel aan een container (bijv. 15 cm plastic Petrischaal) met dubbele zijtape. Blaas het stof van de wafer met behulp van stikstofgas. Om te verzanden, plaatst u de SU-8-gedeponeerde wafel in een vacuümkamer samen met een kleine container (bijv. 35 mm schotel). Laat 10 μL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlooretlooretilane in de kleine container vallen. Breng de (tridecafluoro-1,1,2,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichloortilane niet rechtstreeks aan op SU-8 wafer. Sluit de vacuümkamer goed en zet een vacuümpomp minstens 2 uur aan. Neem een plastic beker en giet het siliconen elastomeer (bijv. Silpot 184 of gelijkwaardig Sylgard 184) en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1. Meng vervolgens goed met behulp van een spatel en ontgas in de vacuümkamer totdat de bellen volledig zijn verwijderd. Giet het PDMS-mengsel met de SU-8 wafer in de container tot de gewenste dikte (3-4 mm) en ontgas opnieuw om bellen te verwijderen. Bak de PDMS in een oven op 60 °C gedurende ten minste 3 uur om het PDMS volledig uit te harden. Snijd na het koelen het uitgeharde PDMS van de wafel af met behulp van een scalpel of een scheermesje. Om de twee kamers van de weefselkweekchip te creëren, ponst u twee gaten waar de twee compartimenten zich bevinden met behulp van een biopsiepons met een diameter van 1,5 mm. Om een medium reservoir te creëren, bereidt u een ander PDMS-mengsel (siliconen elastomeer en het uithardingsmiddel met een gewichtsverhouding van 10:1) en giet u het in een nieuwe Petrischaal van 10 cm. Stel het gietvolume in op 5 mm dikte PDMS. Bak de PDMS in een oven op 60 °C gedurende ten minste 3 uur om het PDMS volledig uit te harden. Na het koelen van het PDMS, snijd het uitgeharde PDMS af met een scalpel om een rechthoekige ring te krijgen. Verlijm de onderste laag met het medium reservoir door er ongedekte PDMS tussen aan te brengen en de geassembleerde PDMS-lagen te bakken. Deze gebonden structuur resulteert in de PDMS weefselkweekchip. Reinig de PDMS weefselkweekchip met een scotch tape om stof en kleine deeltjes van het oppervlak te verwijderen. PDMS-weefselkweekchips kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen als ze worden beschermd tegen stof en UV. 3. Voorbereiding van cultuur Het middelgrote van de cultuurOPMERKING: Alle onderstaande media moeten worden gefilterd op sterilisatie, tenzij anders vermeld. Bereide media mogen bij 4 °C worden bewaard en binnen een maand worden gebruikt. Om mTeSR Plus medium te bereiden: combineer één fles van 100 ml mTeSR Plus 5x supplement met één fles van 400 ml mTeSR Plus Basal Medium. Om 100 ml KSR-medium te bereiden: Voeg in 85 ml DMEM/F12 15 ml Knockout serumvervanging (KSR, 15%), 1 ml commercieel glutaminesupplement (1%) en 1 ml niet-essentieel aminozuur (NEAA, 1%). Om 100 ml N2-medium te bereiden: Voeg in 100 ml neurobasaal medium 1 ml N2 (100x), 1 ml commercieel glutaminesupplement en 1 ml NEAA toe. Om 250 ml rijpingsmedium voor te bereiden: Voeg in 250 ml neurobasaal medium 5 ml B27 (2%), 2,5 ml commercieel glutaminesupplement (1%) en 2,5 ml penicilline/streptomycine (1%) toe. Resuspend de verbindingen (retinoïnezuur (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in cel-cultuur-grade DMSO tot de gewenste concentratie. Bereid aliquots en bewaar ze tot 6 maanden bij -20 °C. De volgende voorraadoplossingen worden gebruikt: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632. CoatingOPMERKING: Om polymerisatie van keldermembraanmatrix door warmte te voorkomen, vermijdt u herhaalde vriesdooicycli. Behandel indien mogelijk alle coatingprocedures met voorgekoelde pipetpunten en buizen. De keldermembraanmatrix moet ‘s nachts bij 4 °C worden ontdooid en met behulp van voorgekoelde pipetpunten en -buizen worden geïciteerd. De aliquots kunnen worden ingevroren bij -20 °C of -80 °C. Ontdooi de bevroren aliquot bij 4°C op ijs. De aliquot moet koud worden gehouden tijdens de coatingprocedure. Verdun met behulp van een voorgekoelde pipettip de keldermembraanmatrix met ijskoude DMEM/F12 in een verhouding van 1:40. Ongebruikte verdunde keldermembraanmatrix kan 2-3 dagen bij 4 °C worden bewaard, aangezien er geen polymerisatie heeft plaatsgevonden. Voeg 1 ml van de keldermembraanmatrix/DMEM-F12-oplossing toe om een put van de 6 putplaat te coaten. Incubeer de plaat minstens een uur op kamertemperatuur, of 4 °C ‘s nachts. Gecoate platen kunnen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard. 4. Onderhoud van iPS-cellen OPMERKING: Ongedifferentieerde iPS-cellen worden onderhouden in mTeSR Plus medium en sub-gekweekt wanneer gelijktijdigheid van ≥ 90% wordt waargenomen in een 6 putplaat in dit protocol. Er kunnen kleine aanpassingen nodig zijn voor iPS-cellen die in andere media worden gekweekt. Bereid keldermembraan matrix gecoate gerechten zoals eerder vermeld in stap 3.2. Aspireer het mTeSR Plus medium volledig. Was de put eenmaal met PBS en voeg 0,5 ml passagingreagens toe (zie Tabel met materialen). Wacht een paar seconden en aspirate de oplossing. Incubeer de plaat op 37 °C in de incubator gedurende 5 minuten of totdat de cellen rond worden.OPMERKING: De incubatietijd kan variëren tussen verschillende iPS-cellijnen en de samenvloeiing. Controleer regelmatig onder de microscoop om de dissociatietijd tijdens de incubatie te bepalen. Voeg 1 ml mTeSR Plus medium toe en tik 30-60 s op de plaat om de kolonies los te maken. Meng voorzichtig 1 ml van de celsuspensieoplossing met 7 ml verse mTeSR plus medium. Niet meer dan 5 keer pipetten. Plaat met een verhouding van 1:8. Voeg meestal 1 ml van de suspensie toe vanaf stap 4.5 en voeg 1 ml mTeSR plus media toe aangevuld met 5-10 μM Y-27632 (ROCK-remmer). De doorgangsverdunningsverhouding is afhankelijk van de iPSC-lijn. Plaats de cel in een incubator van 5% CO2/37 °C. Verwijder de volgende dag Y-27632 door een nieuw mTeSR Plus medium toe te voegen. Verander daarna in eerste instantie om de andere dag van media en elke dag wanneer de cel een hogere confluency bereikt. 5. Differentiatie van iPS-cellen in motorneuronen OPMERKING: Alle onderstaande opties (5.2, 5.3 en 5.4) produceren MBO’s met > 90% efficiëntie. Passivering iPSC voor motorische neuron differentiatieOPMERKING: Differentiatie kan met succes worden uitgevoerd in 3D-protocollen (5.2) of 2D -protocollen (5.3). Laat ongedifferentieerde iPS-cellen groeien totdat het een samenvloeiing van ongeveer 80% bereikt in mTeSR Plus-medium in een plaat met 6 putten. Zuig het medium volledig aan. Was de put onmiddellijk met steriele PBS en voeg 0,5 ml celdissociatieoplossing toe aan de cellen. Incubeer de plaat bij 37 °C in de incubator gedurende ongeveer 2-3 minuten, of totdat cellen gescheiden en rond worden, maar aan de put blijven vastzitten. Voeg 1 ml medium toe en pipet voorzichtig een paar keer op en neer met een serologische pipet van 5 ml. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml bestaande uit 4 ml van het medium. Centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min. Adem de supernatant voorzichtig aan, laat de pellet ongestoord en resuspendeer de cellen in 1 ml van het medium aangevuld met 10 μM Y-27632. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en ga verder met 5,2 (3D-differentiatie) of 5,3 (2D-differentiatie). Vorming van motorneuronenferoïde (MNS) bij 3D-differentiatie (“3D-protocol”)OPMERKING: Een volledige middelgrote verandering wordt dagelijks uitgevoerd vanaf dag 0-12 van differentiatie (figuur 2). Zaai de iPS-cellen van stap 5.1.7 tot een 96 put U bodemplaat op 40.000 cellen/put in 100 μL mTeSR Plus aangevuld met 10 μM Y-27632. Vervang de volgende dag elke put door 100 μL van het verse medium. Op dag 0 en 1: Aspirateer het kweekmedium en vervang door 100 μL KSR medium (3.1.2) aangevuld met 10 μM SB431542 en 100 nM LDN-193189. Op dag 2 en 3: Aspirateer het kweekmedium en vervang door 100 μL KSR medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 4 en 5: Bereid een gemengd medium voor bestaande uit 75% KSR medium en 25% N2 medium (3.1.3). Aspirateer vervolgens het kweekmedium en vervang het door 100 μL gemengd medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 6 en 7: Bereid een gemengd medium bestaande uit 50% KSR medium en 50% N2 medium. Aspirateer vervolgens kweekmedium en vervang het door 100 μL gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinoïnezuur en 1 μM SAG. Op dag 8 en 9: Bereid een gemengd medium bestaande uit 25% KSR medium en 75% N2 medium. Vervolgens aspiratie kweekmedium en vervangen door 100 μL gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 10 en 11: Vervang medium door 100 μl N2 medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 12: Ga verder met het overbrengen van de MN’s in de weefselkweekchip (stap 6) of vervang het medium door 100 μL van het rijpingsmedium (3.1.4) aangevuld met 20 ng/ml hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF).OPMERKING: De MNS kan vanaf dag 12 tot dag 19 worden overgebracht naar de weefselkweekchip. Sferoïden die niet worden overgedragen, moeten worden gekweekt in 96 goed U-bodemplaten in rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF tot overdracht. (Alternatieve optie) 2D-differentiatie en overgang naar 3D MNS (“2D-protocol”) Aspirateer de coatingoplossing uit een voorgecoate 12 putplaat. Zaai de iPS-cellen uit stap 5.1.7 met een dichtheid van 100.000 – 200.000 cellen per put in mTeSR Plus medium met 10 μM Y-27632.OPMERKING: Blijf de ongedifferentieerde iPS-cellen cultiveren in mTeSR Plus-medium zonder Y-27632 totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken als de cellen te schaars zijn voor de volgende stap (5.3.3). Op dag 0 en 1: Aspirate kweekmedium en vervangen door 1 ml KSR-medium (3.1.2) aangevuld met 10 μM SB431542 en 100 nM LDN-193189. Op dag 2 en 3: Aspirate kweekmedium en vervang het door 1 ml KSR-medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 4 en 5: Bereid een gemengd medium voor bestaande uit 75% KSR medium en 25% N2 medium (3.1.3). Aspirate kweekmedium en vervang door 1 ml gemengd medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 6 en 7: Bereid een gemengd medium bestaande uit 50% KSR medium en 50% N2 medium. Aspirateer het kweekmedium en vervang het door 1 ml gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinoïnezuur en 1 μM SAG. Op dag 8 en 9: Bereid een gemengd medium bestaande uit 25% KSR medium en 75% N2 medium. Aspirateer het kweekmedium en vervang door 1 ml van het gemengde medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 10 en 11: Vervang medium door 1 ml N2 medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG. Op dag 12: Aspirateer het differentiatiemedium, was snel goed eenmaal met PBS en voeg 0,5 ml van het celloslatingsmedium toe. Plaats de plaat gedurende 1-3 minuten in een incubator van 37 °C (bijv. bij gebruik van TrypLE Express) of 20-30 min (bijv. bij gebruik van Accutase). Verzamel met behulp van een P1000 pipet voorzichtig de cellen en breng de cellen over in een conische buis van 15 ml met vers rijpingsmedium en centrifugeer gedurende 3 minuten op 200 x g. Als cellen klonterig zijn, pipetteer dan een paar keer zachtjes op en neer. Pipetteer niet te veel, omdat dit schade aan de cellen kan veroorzaken. Aspirateer de supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml rijpingsmedium (3.1.4) aangevuld met 20 ng/ml BDNF. Tel de cel met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen op 10.000-40.000 cellen per put in een 96 put U bodemplaat in Rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF. De initiële zaaidichtheid moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de iPS-cellijn en de toestand van cellen, zodat de diameter van de sferoïde 800-900 μm is wanneer deze in de weefselkweekchip wordt geïntroduceerd. Begin in de meeste gevallen in eerste instantie bij 20.000 cellen per put en verhoog of verlaag vervolgens het aantal cellen op basis van de grootte. Kweek nog 3-10 dagen tot de cellen een sferoïde vormen met een gladde rand. (Alternatieve optie): MNS-vorming uit motorneuronenOPMERKING: In de handel verkrijgbare menselijke iPS-cel-afgeleide motorneuronen (zie Tabel met materialen)kunnen worden gebruikt om MBO’s te genereren in plaats van te differentiëren van menselijke iPS-cellen. Na het ontdooien van de cryoviale motorneuronen, snel resuspend de cellen met 9 ml van de motor neuronen medium. Draai op 400 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Aspirateer de supernatant en resuspend de pellet met het motorische neuron medium. Volg dezelfde stappen als hierboven (5.3.12- 5.3.13) om MNS’s te produceren. 6. Voorbereiding van de weefselkweekchip voor motorische zenuw organoïde (MNO) vorming Steriliseer het bereide PDMS (vanaf stap 2.13) door het gedurende ten minste 1 uur onder te dompelen in 70% ethanol in de Petrischaal.OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden gemanipuleerd in een bioveiligheidskast. Steriliseer het microscoopglas (76 x 52 mm) door het onder te dompelen in 70% ethanol in de Petrischaal. Plaats tijdens het droogproces van het microscoopglas het PDMS-apparaat op het half natte microscoopglas en laat het volledig drogen door ‘s nachts te wachten. Zodra het volledig is gedroogd, moet het PDMS-apparaat zich aan het glas hechten.OPMERKING: Deze hechting is niet permanent om het losmaken van de PDMS-apparaten van het microscoopglas na de cultuur voor weefselverzameling mogelijk te maken. Permanente binding door zuurstofplasma kan worden gebruikt om de hechting tussen PDMS en glas te maximaliseren, maar het zou demontage van de chips en weefselverzameling verbieden. Bedek het oppervlak van de microkanaal in PDMS-apparaat en microscoopglas met 30 μL verdunde keldermembraanmatrix in DMEM/F12 (1:40) door een druppel aan één kant van de inlaat van het kanaal te maken en vervolgens de oplossing van de andere kant van de inlaat aan te zuigen met een pipet of zuigpomp (figuur 3A). Zuig niet te veel hoeveelheid oplossing aan om besmetting met bellen te voorkomen. Incubeer vervolgens het PDMS-apparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of ‘s nachts bij 4 °C in een secundaire container (bijv. Petrischaal). 7. Motorische zenuw organoïde (MNO) vorming Vervang de coatingoplossing door voorverwarmd 150 μL rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF vlak voor gebruik. Plaats vervolgens de MNS van stap 5.2.9 of 5.3.13 in de inlaat van de microkanaal met behulp van een micropipette met een tip met brede boring. MNS kan zich spontaan aan de onderkant van het apparaat nestelen door de zwaartekracht. Oefen niet te veel druk uit bij het injecteren van de MNS (figuur 3B).OPMERKING: Als de MNS vastzit aan de zijwand van een gat in een weefselkweekchip, aspireer de oplossing dan voorzichtig vanaf een andere kant van de inlaat. Vul een klein reservoir (bijv. een dop van 15 ml buis) met steriel water en plaats het in de buurt van de weefselkweekchip in de secundaire container om gemiddelde verdamping te voorkomen. Plaats het vervolgens in een CO2 /37°C incubator van 5%. Voor een middelgrote verandering, aspirateer het uitgeputte cultuurmedium uit het midden van het middelgrote reservoir (figuur 3C). Aspirateer niet al het medium en het weefsel. Voeg voorzichtig een vers rijpingsmedium toe (met BDNF). Het medium moet elke 2-3 dagen worden gewijzigd. Droog het kweekmedium op geen enkel moment tijdens de cultuur. Axonen groeien van een MNS in het kanaal en assembleren spontaan in één bundel in 2-3 weken, wat resulteert in de vorming van een MNO. MNO kan meer dan 1 maand extra in het apparaat worden gekweekt. 8. Downstream-analyse van MNO Immunostaining op de hele berg Breng het apparaat of de borden naar een chemische afzuigkap. Fix MNO door ongeveer gelijk volume van 8% paraformaldehyde (PFA) aan de media toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 4% PFA te bereiken. Verwijder het PDMS-apparaat van het glas en incubeer gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur. Was de MNO met PBS en herhaal vervolgens de PBS-was 2x. Permeabiliseer de MNO met 0,2% Triton X-100 in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de MNO met PBS en herhaal vervolgens de PBS-was 2x. Blokkeer vervolgens de MNO met PBS die 1% BSA bevat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun primaire antilichamen in PBS die 0,1% BSA bevatten en incubeer MNO met de primaire antilichaamoplossing ‘s nachts bij 4 °C. Was de MNO drie keer met PBS. Verdun secundaire antilichamen in PBS met 0,1% BSA en incubeer MNO gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met de secundaire antilichaamoplossing. Was de MNO vervolgens drie keer met PBS. Beits de MNO met Hoechst in PBS met 0,2% Triton-X en broed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de MNO drie keer met PBS. De immunostained MNO is klaar voor beeldvorming met fluorescerende of confocale lasermicroscopen. Weefselverzameling en isolatie van axonbundel Giet 10 ml HBSS-oplossing in een Petrischaal van 10 cm. Dompel vervolgens het hele PDMS-apparaat onder in de HBSS-oplossing. Maak het PDMS voorzichtig los van het microscoopglas onder een stereomicroscoop. Wanneer de weefsels aan het PDMS-apparaat blijven kleven, breng u voorzichtig 1 ml HBSS-oplossing aan vanaf de bovenkant van het gat met behulp van een pipet. Zodra het weefsel van het PDMS afkomt, brengt u voorzichtig 1 ml HBSS aan op het microscoopglas om het PDMS volledig los te maken van het microscoopglas. Om een axonbundel te isoleren van een sferoïde, snijd je de axonbundel met een chirurgisch mes of pincet onder de microscoop. Snijd de axonbundel iets ver weg (> 1 mm) van de sferoïde om besmetting van gemigreerde cellen te voorkomen. Geïsoleerde axonbundels en sferoïden kunnen verder worden geanalyseerd door verschillende downstream-analyses zoals RT-PCR, RNA-seq en western blotting. De PDMS-cultuurchip kan worden hergebruikt. Om de kweekchip schoon te maken, soniceer je de kweekchip gedurende 15 minuten in gedestilleerd water. Soniceer vervolgens de chip in gedestilleerd water aangevuld met 1% wasmiddel. Was de kweekchip 5 keer met gedestilleerd water. Calcium beeldvormingOPMERKING: Neuronale activiteit kan worden gemeten met calciumindicator zowel voor als na het verzamelen van weefsel uit de weefselkweekchip (vanaf 8.2). Het protocol is gebaseerd op een specifieke commerciële kit (zie Materialentabel). Als alternatief kunnen andere Calcium imaging kits of gelijkwaardige methoden worden gebruikt. Was de MNO drie keer met PBS (zonder Ca2+ en Mg2+). Incubeer het weefsel met 5 μM Fluo-4AM in registratiemedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2,1,8 mM, CaCl2,13,8 mM glucose) gedurende 30-60 min bij 37 °C. Een toevoeging van 0,01-0,02 % pluronische F-127 kan helpen bij de opname van Fluo-4 AM in de cellen. Was vervolgens het weefsel met PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) en vervang het door opnamemedium. Verkrijg time-lapse-afbeeldingen met behulp van fluorescerende microscopie met een GFP/Cy2-filterset. Stel de belichtingstijd in op minder dan 20 ms per frame. Open het verkregen filmbestand als een afbeeldingsreeks met afbeelding J. Als u een ccd- of CMOS-kleurencamera gebruikt, converteert u RGB-afbeeldingen naar 16-bits monoafbeeldingen. Openen> | analyseren Hulpmiddelen | ROI Manager”, Teken de interesseregio en klik op “Toevoegen”. Klik op “Multi Measure”. Het gemiddelde van de intensiteit in meerdere ROI’s wordt weergegeven in het resultaat. Plot de verandering van signaalintensiteit met behulp van algemene data-analysesoftware. Meting van neuronale activiteit door multi-elektrode arrayOPMERKING: De activiteit van motorneuronen kan worden vastgelegd door een multi-elektrode array (MEA). Breng deze na het maken van een MNO over op een mea-sonde met keldermembraanmatrixcoating. Plaats het weefsel op elektroden. Voeg 200 μL rijpingsmedium toe en incubeer 1-2 uur bij 37 °C om de MNO aan het oppervlak te laten hechten. Vervang het medium door opnamemedium (8.3.2). Plaats eventueel gaas en gewicht bovenop een MNO om het contract met de elektroden te verhogen. Stel de MEA-sonde in op het opnamehoofdstadium. Veeg het contact tussen de MEA-sonde en de kopfase af met 70% ethanol. Begin met het registreren van neuronale activiteit door de instructies van de fabrikanten van de MEA op te volgen.