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Bioengineering

Imagem e quantificação da área de microbolhas em movimento rápido usando uma câmera de alta velocidade e análise de imagem

Published: September 05, 2020
doi:
10.3791/61509
, , ,
1School of Dentistry,University of Birmingham, 2Department of Mathematics,University of Birmingham

Summary

Microcompletos de cavitação são imagens usando uma câmera de alta velocidade ligada a uma lente de zoom. A configuração experimental é explicada, e a análise de imagem é usada para calcular a área da cavitação. A análise da imagem é feita usando ImageJ.

Abstract

Uma técnica experimental e de análise de imagem é apresentada para bolhas de cavitação de imagem e cálculo de sua área. A técnica experimental de imagem de alta velocidade e o protocolo de análise de imagem aqui apresentado também podem ser aplicados para bolhas microscópicas de imagem em outros campos de pesquisa; portanto, ele tem uma ampla gama de aplicações. Aplicamos isso à cavitação de imagem em torno de escaladores ultrassônicos dentários. É importante imaginar a cavitação para caracterizá-la e entender como ela pode ser explorada para várias aplicações. A cavitação que ocorre em torno de escaladores ultrassônicos dentários pode ser usada como um novo método de remoção de placas dentárias, o que seria mais eficaz e causaria menos danos do que as técnicas atuais de terapia periodontal. Apresentamos um método para a imagem das nuvens de bolha de cavitação que ocorrem em torno de pontas de escalador ultrassônico dental usando uma câmera de alta velocidade e uma lente zoom. Também calculamos a área de cavitação utilizando análise de imagem de aprendizado de máquina. O software de código aberto é usado para análise de imagens. A análise de imagem apresentada é fácil de replicar, não requer experiência de programação, e pode ser modificada facilmente para se adequar à aplicação do usuário.

Introduction

A imagem do movimento das bolhas é importante para várias aplicações porque controla a hidrodinâmica de um sistema. Existem muitas aplicações onde isso pode ser útil: em reatores de cama fluidizados1,,2, ou para limpeza com bolhas de cavitação3,,4. O objetivo das bolhas de imagem é entender mais sobre a dinâmica da bolha ou sobre a direção e o movimento de uma nuvem de bolhas. Isso pode ser feito através da observação de estruturas imagens e também usando análise de imagem para obter informações quantitativas, como o tamanho das bolhas.

Bolhas de cavitação são entidades de gás ou vapor que ocorrem em um fluido quando a pressão cai abaixo do valor de pressão saturada5. Eles podem ocorrer quando um campo acústico é aplicado a um fluido em frequências ultrassônicas. Eles crescem e entram em colapso repetidamente, e após o colapso podem liberar energia na forma de micro-jatos de alta velocidade e ondas de choque6,,7. Estas podem desalojar partículas em uma superfície através de forças de tesoura e causar limpeza da superfície8. Bolhas de cavitação estão sendo investigadas para limpeza de superfície em diferentes indústrias, como para semicondutores, alimentos e limpeza de feridas9,,10,,11,12. Eles também poderiam ser usados para limpar placas dentárias de dentes e biomateriais, como implantes dentários12,13. A cavitação ocorre em torno de instrumentos dentários atualmente utilizados, como escaladores ultrassônicos e arquivos endodônticos e mostra potencial como um processo de limpeza adicional com esses instrumentos14.

A oscilação das bolhas de cavitação ocorre ao longo de alguns microsegundos e, portanto, uma câmera de alta velocidade é necessária para capturar seu movimento por imagem em milhares de quadros por segundo8. Demonstramos um método de cavitação de microbolhas de imagem em torno de escaladores ultrassônicos dentários. O objetivo é entender como a cavitação varia em torno de diferentes escaladores ultrassônicos, para que possa ser otimizado como uma nova maneira de limpar a placa dentária.

Métodos anteriores utilizados para investigar a cavitação incluem sonochemiluminesence, que usa luminol para detectar onde ocorreu a cavitação15,16. No entanto, esta é uma técnica indireta e não é capaz de visualizar as bolhas de cavitação em tempo real. Portanto, ele não é capaz de determinar com precisão exatamente onde ele acontece no instrumento, e nenhuma informação pode ser obtida sobre a dinâmica da bolha, a menos que seja combinada com outras técnicas de imagem17. Imagens de alta velocidade podem imaginar não apenas as bolhas de cavitação crescendo e colapsando, mas também o tipo de cavitação que ocorre: nuvens de cavitação, microstreamers e micro-jatos6,,7,,18. Estes dão mais informações sobre como a cavitação pode limpar superfícies.

Apresentamos um método de microbolhas de cavitação de imagem usando uma câmera de alta velocidade e calculando a área média de cavitação ocorrendo. Este método é demonstrado usando um exemplo de cavitação ocorrendo em torno de diferentes pontas de escalador ultrassônico dentário, embora as etapas experimentais e de análise de imagem possam ser usadas para outras aplicações, como para imagens de outras macro e microbolhas.

Protocol

1. Configuração do instrumento Selecione o instrumento ou objeto a ser visualizado. Neste experimento, um escalador ultrassônico foi imageado. Bolhas de cavitação ocorrem ao redor das pontas dos escaladores ultrassônicos na água. Selecione um estágio de micro posicionamento para que o instrumento seja imagedo com tradução e rotação XYZ. Coloque em um valete de laboratório. Conecte a alça do instrumento ao estágio de micro posicionamento Selecione um recipiente de água opticamente transparente para imagens. O recipiente usado nesses experimentos foi criado com lâminas de microscópio de vidro. Selecione um estágio XY com uma plataforma de rotação. Coloque em um valete de laboratório. Coloque o recipiente de água no palco e encha com água filtrada (osmose reversa ou destilada). 2. Configuração da câmera de alta velocidade Selecione uma câmera de alta velocidade com a taxa e resolução de quadros desejados e uma fonte de luz de alta intensidade com um guia de luz de fibra. Conecte uma placa deslizante de microposicionamento ao corpo da câmera de alta velocidade e conecte-a a um suporte de tripé. Selecione uma lente com a resolução e distância focal desejada e conecte-a à câmera. Para este experimento, uma lente zoom foi usada com uma resolução de 8,4 μm/pixel. Encha o tanque de imagem com água e posicione a ponta do instrumento a ser visualizada na caixa d’água na orientação desejada. Depois de conectar a câmera e carregar a visão ao vivo no software, use baixa ampliação para focar na ponta do escalador ultrassônico, reposicionando a fonte de luz, se necessário. Posicione o instrumento e a fonte de luz na frente da câmera e se concentre. Ajuste à taxa de quadros e brilho desejados.NOTA: É necessária uma maior intensidade de luz para imagens em altas taxas de quadros, velocidades curtas do obturador e/ou altas ampliações. A iluminação pode ser fornecida no modo de reflexão ou no modo de transmissão. Neste protocolo, a iluminação é fornecida no modo de transmissão (campo brilhante) usando um dispositivo de iluminação a frio de alta intensidade. Defina uma taxa de quadros ideal e velocidade do obturador para a câmera de alta velocidade. Neste experimento, a taxa de quadros foi de 6400 fps com uma velocidade de obturador de 262 nanossegundos. Uma velocidade de obturador curta é necessária para bolhas em movimento rápido, como bolhas de cavitação para garantir que elas estejam em foco. Ajuste a ampliação da lente de zoom e a intensidade da fonte de luz para que o fundo fique branco sem ser superexposto. 3. Calibração Regissão a posição da ponta (rotação no estágio x-y, ângulo de rotação do instrumento para reprodutibilidade). Para garantir que o campo de visão seja consistente para cada repetição, escolha um ponto de referência e anote as coordenadas. Neste caso, o ponto de referência foi a ponta do escalador ultrassônico. Ele pode então ser reposicionado em experimentos futuros no mesmo lugar dentro do campo de visão. Se o tamanho do pixel for desconhecido, exaúbula um raláculo com marcações de 10 μm no conjunto de ampliação e use software de análise de imagem como Fiji para calcular a resolução. 4. Gravação de vídeo em alta velocidade Imagem do instrumento sem cavitação. Isso será subtraído das imagens de cavitação na análise de imagens ao calcular a área das bolhas de cavitação. Salve os vídeos em um formato como TIFF para que nenhuma qualidade de imagem seja perdida. Imagem do instrumento que opera com cavitação. Certifique-se de que há quadros suficientes para análise precisa, por exemplo, 5 repetições com 500 quadros cada. 5. Processamento de imagem Baixe Fiji19 no site imagej (https://imagej.net/Fiji). Foi fornecido um código macro ImageJ que faz automaticamente as etapas de análise de imagem descritas abaixo e também pode ser alterado para se adequar ao aplicativo. As etapas individuais da macro são descritas nas etapas 5.3-5.5. Corte a imagem para remover quaisquer áreas mais escuras resultantes de iluminação irregular, se necessário. Certifique-se de que todas as imagens sejam cortadas para o mesmo tamanho e no ponto idêntico da imagem. Converta as imagens em binárias, cortando automaticamente usando um dos limiares automáticos. Neste exemplo, o limiar automático mínimo é usado. Execute o comando de furos de enchimento para remover quaisquer pixels pretos de dentro das bolhas que foram falsamente segmentadas. Calcule o histograma da pilha para mostrar o número de pixels correspondentes ao scaler e à cavitação em cada quadro. Neste caso, os pixels correspondentes às bolhas são brancos e têm valor 255. Guarde essas medidas. Repita as etapas 5.3-5.6 para o vídeo do instrumento que opera sem as bolhas. Calcule a área média da ponta do escalador ultrassônico apenas a partir dos resultados do histograma. Subtrair a área média do instrumento de cada uma das áreas calculadas a partir dos vídeos das bolhas ao redor do scaler. A área das bolhas é deixada para medir. Visualize subtraindo a imagem binária do scaler da imagem binária do scaler com bolhas usando a calculadora de imagem em Fiji. Calcule o desvio médio e padrão da área das bolhas. Converta os valores do número de pixels em área (neste caso μm2) multiplicando-se pelo tamanho do pixel ao quadrado. Calcule o tamanho de cada pixel por imagem de um ralticule com a câmera de alta velocidade na mesma ampliação que foi usada para imagem e use ImageJ para definir a escala. Trace os dados. Também é possível realizar análises estatísticas para mostrar qualquer diferença significativa na área das bolhas se comparar condições diferentes. 6. Macro ImageJ No menu ImageJ/Fiji, vá para Plugins > New > Macro. Certifique-se de que o IJ1 Macro seja verificado no menu do idioma e copie e cole o seguinte código. Clique em executar para executar a macro(Arquivo Suplementar).

Representative Results

As etapas de análise de imagem podem ser vistas na Figura 1 para uma das pontas do escalador ultrassônico testadas. Uma ponta FSI 1000 e uma ponta de 10P foram imagens dentro de um reservatório de água com a água de resfriamento desligada (Figura 2). A cavitação ocorreu perto da curva da ponta FSI 1000 com potência máxima, e perto da extremidade livre na ponta 10P(Figura 3 e Figura 4). A área média de cavitação foi de 0,1 ± 0,07 mm2 para a ponta FSI 1000 e 0,50 ± 0,25 mm2 para a ponta de 10P(Figura 5). Figura 1: Etapas de configuração de imagem e análise de imagem de alta velocidade(a) Esquema da configuração de imagem de alta velocidade utilizada no estudo. (b) Esquema das etapas de análise de imagem utilizadas no estudo, mostrando as imagens brutas à esquerda apenas da ponta do escalador e com cavitação, que foram então binarizadas e subtraídas umas das outras para calcular a área das nuvens de cavitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Comparação entre diferentes pontas Imagens de alta velocidade mostrando cavitação ocorrendo em torno das duas pontas de escalador ultrassônico testadas (a) FSI 1000 (b) 10P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Imagens de alta velocidade da ponta 10P: Imagens de alta velocidade da ponta 10P, a partir de um vídeo feito a 6400 quadros por segundo. Cavitação pode ser vista em torno da extremidade livre da ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Imagens de alta velocidade do FSI1000: Imagens de alta velocidade da ponta FSI 1000, a partir de um vídeo feito a 6400 quadros por segundo. Cavitação pode ser vista no meio da ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Resultados de análise de imagem da área de cavitação. A área média de cavitação ocorrendo em torno das pontas de escalador ultrassônico FSI 1000 e 10P calculadas usando a técnica de análise de imagem descrita. As barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A técnica descrita neste artigo permite a imagem de microbolhas em movimento rápido com alta resolução espacial e temporal. Pode potencialmente beneficiar uma ampla gama de disciplinas científicas, como engenharia química, odontologia e medicina. As aplicações de engenharia incluem bolhas de cavitação de imagem para limpar superfícies, ou para bolhas de imagem em reatores de leitos fluidizados. Aplicações biomédicas incluem cavitação de imagem em torno de instrumentos médicos e dentários e debridamento de biofilme de imagem de tecido duro e mole usando bolhas de cavitação. Neste estudo demonstramos a técnica por cavitação de imagem em torno de duas diferentes pontas de escalador ultrassônico dentário. A quantidade de cavitação varia entre as duas pontas testadas neste estudo, com mais nuvens de cavitação observadas ao redor da extremidade livre da ponta 10P. Isso já foi anteriormente ligado à amplitude de vibração20. Os vídeos de alta velocidade mostram que a ponta FSI 1000 tem menos vibração, o que provavelmente é o motivo pelo qual há menos cavitação ao redor desta ponta.

Uma limitação do método de análise de imagem é que a técnica de subtração de imagem para remover a área do scaler não é completamente precisa porque o scaler está oscilando e, portanto, a subtração pode deixar algumas áreas do scaler falsamente segmentadas como bolhas. No entanto, isso foi explicado pela média da área a partir de um grande número de quadros (n=2000). Isso não seria um problema para aplicações onde o objeto a ser subtraído está parado. Para estudos em que o objeto móvel a ser subtraído tenha uma variância muito maior, recomendamos sincronizar os movimentos em ambos os vídeos antes de subtrair para resultados precisos. No presente estudo, não sincronizamos as oscilações, mas como a vibração era baixa, podemos supor que as oscilações correspondem bem umas às outras nessas duas medidas.

O limiar de imagem é preciso porque a iluminação brightfield fornece um fundo uniforme com bom contraste. É fundamental garantir que o fundo seja uniforme e não contenha outros objetos que possam ser falsamente segmentados. O método de limiar pode ser modificado usando outros limiares automáticos para se adequar ao aplicativo. O limiar manual, onde o usuário define o valor do limiar, também é possível, mas não é recomendado, pois reduz a reprodutibilidade dos resultados, uma vez que diferentes usuários selecionarão diferentes valores de limiar.

A análise de imagem tem sido usada para muitos outros estudos de imagem de bolhas. Estes também usam um método semelhante de backlighting para obter o contraste ideal entre as bolhas e o fundo, e limiar para segmentar as bolhas21,22,23,24. O método mostrado no presente estudo também pode ser generalizado para ser usado para muitas aplicações de imagem de bolhas diferentes, que não se limitam apenas a imagens de alta velocidade. Imagens de alta velocidade têm sido usadas para bolhas de cavitação geradas na água e também em torno de instrumentos como arquivos endodônticos e escaladores ultrassônicos12,,25,,26,,27,28. Por exemplo, Rivas et al. e Macedo et al. usaram uma câmera de alta velocidade presa a um microscópio, com iluminação fornecida por uma fonte de luz fria para limpeza de imagem com cavitação, e para a cavitação de imagem em torno de um arquivo endodôntico17,29. A iluminação de campo brilhante proporciona mais contraste entre o fundo e as bolhas, possibilitando o uso de técnicas simples de segmentação, como limiares, como demonstrado por Rivas et al. para imagem e quantificação da erosão e limpeza da cavitação ao longo do tempo29. A iluminação do campo escuro dificulta o limiar devido à maior variação nas escalascinzas 4,,30. A análise de imagens tem sido usada em outros estudos para coletar mais informações sobre bolhas1,,2. Vyas et al. utilizaram uma abordagem de aprendizado de máquina para segmentar bolhas de cavitação em torno de um scaler ultrassônico20. O método descrito no artigo atual é mais rápido porque usa limiares simples, por isso é menos computacionalmente intensivo, e bolhas que ocorrem acima e abaixo do scaler podem ser analisadas. No entanto, o método de limiar usado no papel atual só é preciso se o fundo for uniforme. Se não for possível obter um fundo uniforme durante a imagem, outras técnicas de processamento de imagem podem ser usadas, como o uso de subtração de fundo usando um raio de esfera rolando para corrigir a iluminação irregular, filtrando usando filtros medianos ou gaussianos para remover o ruído, ou também usando técnicas baseadas em aprendizado de máquina20,,31.

Em conclusão, apresentamos um protocolo de imagem e análise de alta velocidade à imagem e calculamos a área de um objeto móvel microscópico. Demonstramos este método por meio de bolhas de cavitação de imagem em torno de um escalador ultrassônico. Pode ser usado para a cavitação de imagem em torno de outros instrumentos dentários, como arquivos endodônticos e pode ser facilmente adaptado para outras aplicações de imagem de bolha não dental.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem o financiamento do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas EP/P015743/1.

Materials

0.25x attachment Navitar 1-50011
12x with 12mm fine focus
Long distance microscope zoom lens		 Navitar 1-50486
2x adaptor with f mount Navitar 1-62922
Cavitron Plus Ultrasonic Scaler Dentsply Sirona 8184003
Cavitron Ultrasonic Insert FSI 1000FSI 1000 Dentsply Sirona UCAFTHD
Fibre light guide. 8mm fibre bundle 1500mm length. Focussing lens assembly for Hayashi light, 1/4"-20 tripod
thread for mounting.		 Hayashi LGC1-
8L1500
Geared head Manfrotto MN405 7.5kg load capacity
HDF7010 High-Power LED Endoscope light
source. 150W LED provides cold output equivalent to 250W
Xenon.		 Hayashi LA-HDF710
Heavy weight Tripod Manfrotto MN475B Geared centre column, 12kg load capacity
High Speed Camera Photron 103526 FASTCAM Mini AX200 900K M3 (16GB memory)
High-Precision Rotation Stage Thorlabs PR01/M
Laboratory jacks Camlab 1194083
Micropositioning sliding plate Manfrotto SKU 454
Micropositioning stage 3D Thorlabs PT3/M
Micropositioning stage rotation Thorlabs OCT-XYR1/M OCT-XYR1/M – XY Stage with Solid Top Plate
NEWTRON P5 XS Ultrasonic Scaler  Acteon F62118
Ultrasonic Insert 10P Acteon F00253
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References

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Vyas, N., Mahmud, M., Wang, Q. X., Walmsley, A. D. Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61509, doi:10.3791/61509 (2020).
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