Travmatik Beyin Hasarına Nöroinflamatuar ve Hemodinamik Yanıtın Sistem Analizi

Genel bakış
Hafif travmatik beyin yaralanmaları (mTBI’lar) yılda ~ 1.6-3.8 milyon sporcuyu etkilemektedir¹. Sub-sarsıntılı ve sarsıntılı yaralanmalar da dahil olmak üzere bu yaralanmalar, hastaları geçici fiziksel, duygusal, psikolojik ve^{bilişsel semptomları} olan 2 bırakabilir. Dahası, bir “güvenlik açığı penceresi” içinde sürdürülen tekrarlayan mTBI (rmTBI^{), tek başına} tek bir mTBI’nın etkilerinden daha uzun süren bilişsel sonuçların kümülatif ciddiyetine ve süresine ve hatta sonuçta ^4,5,6 işlevinin kalıcı kaybına yol açabilir. Birçok hasta nispeten kısa bir zaman diliminde ( mTBI’nın daha uzun süreli etkilerine maruz kalırken, bazıları 1 yıla kadar sürer 3,7,8,9. Bu yaralanmaların yüksek prevalansına ve kalıcı sonuçlarına rağmen, yaralanma mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve etkili bir tedavi stratejisi bulunmamaktadır.

mTBI / rmTBI sonrası sonuçlardaki yüksek değişkenlik göz önüne alındığında, terminal mTBI / rmTBI çalışmalarında elde edilen dokudan erken evre moleküler tetikleyicilerin tanımlanmasındaki bir zorluk, bu moleküler tetikleyicilerin uzun vadeli sonuçlara kesin “akut moleküler bağlantılarını” gösteren uzunlamasına verilerin eksikliğidir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için grubumuz, diffüz korelasyon spektroskopisi (DCS) adı verilen optik bir araç kullanılarak akut olarak ölçülen akut olarak azaltılmış serebral kan akışının, rmTBI^10’un bir fare modelinde uzun vadeli bilişsel sonuçla güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu keşfetti. Bu hemodinamik biyobelirteci kullanarak, akut olarak düşük serebral kan akışına (ve buna bağlı olarak daha kötü tahmin edilen uzun vadeli sonuç) sahip farelerin, hem MAPK hem de NFκB yolaklarında nöronal fosfo-sinyallemede eşlik eden akut artışlara, pro-inflamatuar sitokinlerin nöronal ekspresyonunda artışlara ve fagosit / mikroglial belirteç Iba1^11’in ekspresyonunda artışlara sahip olduğunu gösterdik. . Bu veriler, nöronal fosfo-sinyalleme, sitokin ekspresyonu ve mikroglial aktivasyon için hem yaralanma sonrası serebral kan akışının akut düzenlenmesinde hem de nöronal disfonksiyona ve daha kötü bilişsel sonuçlara yol açan bir sinyal kaskadının tetiklenmesinde olası bir rol olduğunu göstermektedir. Burada, rmTBI sonrası hem hemodinamik hem de nöroinflamatuar ortamı aynı anda araştırmak için yaklaşımımızı ve bu karmaşık veri kümelerinin nasıl entegre edileceğini detaylandırıyoruz. Spesifik olarak, bu kapsamlı yaklaşımın dört temel adımı için prosedürleri özetliyoruz: (1) hafif travmatik beyin hasarının ağırlık verme modeli, (2) serebral kan akışının diffüz korelasyon spektroskopisi ile değerlendirilmesi, (3) nöroenflamatuar ortamın nicelleştirilmesi ve (4) veri entegrasyonu (Şekil 1). Aşağıda, okuyuculara yöntemlerimizin arkasındaki mantık boyunca rehberlik etmeye yardımcı olmak için bu önemli adımların her birine kısa bir giriş sunuyoruz. Makalenin geri kalanı, bu önemli adımların her biri için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Hafif travmatik beyin hasarının ağırlık verme modeli
Tekrarlayan hafif ^TBİ’nin birçok mükemmel preklinik modeli 12,13,14,15,16,17,18 olmasına rağmen, iyi kurulmuş ve klinik olarak ilgili bir ağırlık düşüşü kapalı kafa travması modeli kullanıyoruz. Bu modelin temel özellikleri arasında (1) sağlam kafatası / kafa derisinin künt etkisi ve ardından başın boyun etrafında sınırsız dönmesi, (2) açık yapısal beyin hasarı, ödem, kan-beyin bariyeri hasarı, akut hücre ölümü veya kronik beyin dokusu kaybı ve (3) sadece birden fazla vuruştan sonra ortaya çıkan kalıcı (1 yıla kadar) bilişsel eksiklikler¹⁹ (Şekil 2).

Serebral kan akımının diffüz korelasyon spektroskopisi ile değerlendirilmesi
Diffüz korelasyon spektroskopisi (DCS), kan akışını ölçen invaziv olmayan bir optik tekniktir 5,20,21. DCS’de, doku yüzeyine yakın kızılötesi bir ışık kaynağı yerleştirilir. Doku yüzeyindeki kaynaktan sabit bir mesafeye, dokuya dağılmış olan ışığı tespit etmek için bir dedektör yerleştirilir (Şekil 3). Hareket eden kırmızı kan hücrelerinin saçılması, tespit edilen ışık yoğunluğunun zamanla dalgalanmasına neden olur. Korelasyon difüzyon teorisi olarak bilinen basit bir analitik model, bu yoğunluk dalgalanmalarını bir kan akışı indeksi ile ilişkilendirmek için kullanılır (CBF_i, Şekil 4). CBF i birimleri (cm² / s) geleneksel akış birimleri (mL / dak / 100 g) olmamasına rağmen, farelerde yapılan önceki bir çalışma, CBF_{i’nin MRI} ²¹ etiketli arteriyel spin ile ölçülen serebral kan akışı ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir.

Referans olarak, burada kullanılan DCS cihazı şirket içinde inşa edilmiştir ve 852 nm uzunluğunda bir tutarlılık uzunluğu lazeri, bir dizi 4 foton sayma çığ fotodiyotu ve bir donanım otokorelatör kartından (tek tau, 8 kanal, 100 ns minimum örnekleme süresi) oluşur ^21,22. Veriler, LabView’da yazılmış ev yapımı yazılımlarla elde edilir. Cihazın hayvan arayüzü, 6 mm aralıklarla yerleştirilmiş ve siyah bir 3D baskılı sensöre (4 mm x 8 mm) gömülü 400 μm çok modlu kaynak fiber (400-2200 nm dalga boyu aralığı, saf silika çekirdek, TECS Sert Kaplama, 730 ± 30 nm ikinci mod kesme) ve 780 nm tek modlu dedektör fiberinden (4 mm x 8 mm, Şekil 3).

Nöroinflamatuar ortamın nicelleştirilmesi
Nöroinflamasyon çeşitli hücresel süreçler tarafından düzenlenmesine rağmen, iki temel ilgili mekanizma sitokinler / kemokinler tarafından hücre dışı sinyalizasyon ve fosfo-proteinler tarafından hücre içi sinyalleşmedir. Yaralanma sonrası beynin nöroinflamatuar ortamını araştırmak için, beyinler farelerden çıkarılır, mikrodisseke edilir ve sitokinler / kemokinler ve fosfo-proteinler Luminex kullanılarak ölçülür (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7). Luminex çoklanmış immünotahliller, enzime bağlı immünosorbent tahlillerini (ELISA’lar) floresan olarak etiketlenmiş manyetik boncuklara bağlayarak bu proteinlerin çeşitli koleksiyonlarının eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlar. İlgilenilen her protein için farklı floresan etiketler kullanılır ve her etiketin boncukları, söz konusu proteine karşı bir yakalama antikoru ile işlevselleştirilir. Her proteini yakalamak için yüzlerce boncuk birlikte karıştırılır, 96 kuyucuklu bir tabağa yerleştirilir ve numune ile inkübe edilir. Numune inkübasyonundan sonra, numune yıkanırken boncukları kuyuya hapsetmek için bir mıknatıs kullanılır. Daha sonra, biyotinile tespit antikoru, geleneksel bir ELISA’ya benzer bir antikor-antijen sandviç oluşturmak için ilgilenilen analite bağlanır, ancak farklı bir floresan etiketli boncuk üzerinde meydana gelen her protein için ELISA ile. Fikoeritrin konjuge streptavidin (SAPE) eklenmesi her reaksiyonu tamamlar. Luminex cihazı daha sonra boncukları okur ve sinyali her floresan etiketine / proteinine göre ayırır.

Veri entegrasyonu
Luminex testinde ölçülen çok sayıda analit (örneğin, sitokinler) nedeniyle, her bir nicelleştirilmiş protein ayrı ayrı analiz edilirse, veri analizinin yorumlanması zor olabilir. Analizi basitleştirmek ve analitler arasında gözlemlenen eğilimleri yakalamak için, kısmi en küçük kareler regresyonu adı verilen çok değişkenli bir analiz yöntemi kullanıyoruz (PLSR, Şekil 8)²³. PLSR, ölçülen her proteine (yani, “öngörücü değişkenler” olarak adlandırılan sitokinler veya fosfo-proteinler) karşılık gelen bir ağırlık ekseni tanımlayarak, ölçülen proteinlerin bir yanıt değişkeni (örneğin, serebral kan akışı) ile birlikte en iyi şekilde açıklanmasını sağlayarak çalışır. Ağırlıklar “yüklemeler” olarak adlandırılır ve gizli değişken (LV) olarak bilinen bir vektöre monte edilir. İki LV’nin her birinde ölçülen protein verilerini yansıtarak (“puanlama” olarak adlandırılır), veriler bu LV’ler açısından yeniden çizilebilir. PLSR’yi hesapladıktan sonra, AG’ye yapılan numune projeksiyonları ile öngörücü değişken²⁴ arasındaki kovaryansı en üst düzeye çıkaran yeni bir AG tanımlamak için bir varimax rotasyonu kullanıyoruz. Bu yaklaşım, LV1’i yanıt değişkeninin varyansının en iyi açıklandığı eksen olarak tanımlamamızı sağlar. LV2, yanıt değişkeni ile LV1 artık verileri arasındaki eş-varyansı en üst düzeye çıkarır, bu da numuneler arasındaki biyolojik veya teknik değişkenlikle ilişkilendirilebilir. Son olarak, PLSR modelinin herhangi bir örnek^23’e büyük ölçüde bağımlı olmadığından emin olmak için bir Leave One Out Cross Validation (LOOCV) yürütüyoruz.

Bu protokolde, mTBI’ya nöroinflamatuar ve hemodinamik doku yanıtını karakterize etmek için yöntemleri detaylandırıyoruz. Genel iş akışı Şekil 1’de özetlenmiştir. Bu protokolde, fareler ağırlık düşürme kapalı kafa travması modeli kullanılarak bir veya daha fazla mTBI’ye tabidir. Serebral kan akımı, yaralanmadan önce ve yaralanmadan sonra birden fazla zaman noktasında uzunlamasına ölçülür. Nöroenflamatuar değişikliklerin sorgulanması için ilgi duyulan zaman noktasında, hayvan ötenazi yapılır ve beyin çıkarılır. İlgilenilen beyin bölgeleri mikrodiseksiyon yoluyla izole edilir ve daha sonra proteini çıkarmak için lize edilir. Lisatlar daha sonra hem sitokin hem de fosfo-protein ekspresyonunun Luminex multipleks immünotahlilleri ve ayrıca Western lekesi için kullanılır. Son olarak, bu bütünsel veri kümesi kısmi en küçük kareler regresyon analizi kullanılarak tümleştirilir.