Analisi dei sistemi della risposta neuroinfiammatoria ed emodinamica alla lesione cerebrale traumatica

Panoramica
Lievi lesioni cerebrali traumatiche (mTBI) hanno un impatto ~ 1,6-3,8 milioni di atleti all’anno¹. Queste lesioni, comprese le lesioni sub-concussive e concussive, possono lasciare i pazienti con sintomi fisici, emotivi, psicologici e cognitivi transitori². Inoltre, l’mTBI ripetitivo (rmTBI) sostenuto all’interno di una “finestra di vulnerabilità” può portare a gravità cumulativa e durata delle conseguenze cognitive che durano più a lungo degli effetti di un singolo mTBI da solo³ e, in definitiva, anche alla perdita permanente della funzione ^4,5,6. Sebbene molti pazienti guariscano in un lasso di tempo relativamente breve ( 1 mese, con alcuni che durano fino a 1 anno 3,7,8,9. Nonostante l’elevata prevalenza e le conseguenze durature di queste lesioni, i meccanismi di lesione sono poco conosciuti e non esistono strategie di trattamento efficaci.

Data l’elevata variabilità degli esiti dopo mTBI/rmTBI, una sfida nell’identificare i trigger molecolari in fase iniziale dal tessuto ottenuto negli studi terminali mTBI/rmTBI è la mancanza di dati longitudinali che dimostrino i “legami molecolari acuti” definitivi di questi trigger molecolari a esiti a lungo termine. Per superare questa sfida, il nostro gruppo ha scoperto che il flusso sanguigno cerebrale acutamente ridotto misurato acutamente utilizzando uno strumento ottico chiamato spettroscopia di correlazione diffusa (DCS), è fortemente correlato con l’esito cognitivo a lungo termine in un modello murino di rmTBI¹⁰. Utilizzando questo biomarcatore emodinamico, abbiamo dimostrato che i topi con un flusso sanguigno cerebrale acutamente basso (e, per estensione, un esito a lungo termine peggiore previsto) hanno concomitanti aumenti acuti della segnalazione fosfo neuronale all’interno delle vie MAPK e NFκB, aumenti dell’espressione neuronale delle citochine pro-infiammatorie e aumenti dell’espressione del fagocita/marcatore microgliale Iba1¹¹ . Questi dati suggeriscono un possibile ruolo per la segnalazione fosfo-neuronale, l’espressione di citochine e l’attivazione microgliale sia nella regolazione acuta del flusso sanguigno cerebrale dopo la lesione, sia nell’innescare una cascata di segnalazione che porta a disfunzioni neuronali e peggior esito cognitivo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro approccio per sondare simultaneamente sia l’ambiente emodinamico che neuroinfiammatorio dopo rmTBI e come integrare questi set di dati complessi. In particolare, delineiamo le procedure per quattro passaggi chiave di questo approccio globale: (1) un modello di caduta di peso di lieve lesione cerebrale traumatica, (2) valutazione del flusso sanguigno cerebrale con spettroscopia di correlazione diffusa, (3) quantificazione dell’ambiente neuroinfiammatorio e (4) integrazione dei dati (Figura 1). Di seguito, forniamo una breve introduzione a ciascuno di questi passaggi chiave per aiutare a guidare i lettori attraverso la logica alla base dei nostri metodi. Il resto del manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per ciascuno di questi passaggi chiave.

Modello di calo di peso di lieve lesione cerebrale traumatica
Sebbene esistano molti eccellenti modelli preclinici di TBI lieve ripetitivo 12,13,14,15,16,17,18, impieghiamo un modello di trauma cranico chiuso a caduta di peso ben consolidato e clinicamente rilevante. Le caratteristiche principali di questo modello includono (1) impatto smussato del cranio / cuoio capelluto intatto seguito da rotazione illimitata della testa attorno al collo, (2) nessuna lesione cerebrale strutturale evidente, edema, danno da barriera emato-encefalica, morte cellulare acuta o perdita cronica del tessuto cerebrale e (3) deficit cognitivi persistenti (fino a 1 anno) che emergono solo dopo più colpi¹⁹ (Figura 2).

Valutazione del flusso sanguigno cerebrale con spettroscopia di correlazione diffusa
La spettroscopia di correlazione diffusa (DCS) è una tecnica ottica non invasiva che misura il flusso^{sanguigno 5,20,21}. In DCS, una sorgente di luce nel vicino infrarosso viene posizionata sulla superficie del tessuto. Un rilevatore viene posizionato a una distanza fissa dalla sorgente sulla superficie del tessuto per rilevare la luce che si è moltiplicata dispersa attraverso il tessuto (Figura 3). La dispersione dei globuli rossi in movimento fa sì che l’intensità della luce rilevata fluttui nel tempo. Un semplice modello analitico noto come teoria della diffusione della correlazione viene utilizzato per correlare queste fluttuazioni di intensità a un indice di flusso sanguigno (CBF_i, Figura 4). Sebbene le unità di CBF_i (cm²/s) non siano le tradizionali unità di flusso (mL/min/100 g), uno studio precedente sui topi ha dimostrato che il CBF_i è fortemente correlato al flusso sanguigno cerebrale misurato mediante spin arterioso marcato MRI²¹.

Per riferimento, lo strumento DCS utilizzato qui è stato costruito internamente ed è composto da un laser a lunghezza di coerenza lunga 852 nm, una serie di 4 fotodiodi a valanga di conteggio dei fotoni e una scheda autocorrelatore hardware (singola tau, 8 canali, 100 ns tempo minimo di campionamento)^21,22. I dati vengono acquisiti con software fatti in casa scritti in LabView. L’interfaccia animale per il dispositivo è costituita da una fibra sorgente multimodale da 400 μm (gamma di lunghezze d’onda 400-2200 nm, nucleo di silice pura, rivestimento rigido TECS) e una fibra del rilevatore monomodale da 780 nm (gamma di lunghezze d’onda 780-970 nm, nucleo di silice pura, rivestimento rigido TECS, 730 ± taglio della seconda modalità a 30 nm) distanziati di 6 mm e incorporati in un sensore nero stampato in 3D (4 mm x 8 mm, Figura 3).

Quantificazione dell’ambiente neuroinfiammatorio
Sebbene la neuroinfiammazione sia regolata da diversi processi cellulari, due meccanismi chiave rilevanti sono la segnalazione extracellulare da parte di citochine / chemochine e la segnalazione intracellulare da parte di fosfoproteine. Per studiare l’ambiente neuroinfiammatorio del cervello post-lesione, i cervelli vengono estratti da topi, microsezionati e citochine / chemochine e fosfoproteine vengono quantificate usando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). I saggi immunologici multiplexed Luminex consentono la quantificazione simultanea di una collezione diversificata di queste proteine accoppiando saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA) a perline magnetiche marcate fluorescentmente. Per ogni proteina di interesse vengono utilizzati tag fluorescenti distinti e le perline di ciascun tag sono funzionalizzate con un anticorpo di cattura contro quella particolare proteina. Centinaia di perline per catturare ogni proteina vengono mescolate insieme, poste in una piastra da 96 pozzetti e incubate con il campione. Dopo l’incubazione del campione, viene utilizzato un magnete per intrappolare le perline nel pozzo mentre il campione viene lavato via. Successivamente, l’anticorpo di rilevamento biotinilato si lega all’analita di interesse per formare un sandwich anticorpo-antigene simile a un ELISA tradizionale, ma con l’ELISA per ogni proteina che si verifica su un diverso tallone marcato fluorescentemente. L’aggiunta di streptavidina coniugata con ficoeritrina (SAPE) completa ogni reazione. Lo strumento Luminex legge quindi le perline e separa il segnale in base a ciascun tag/proteina fluorescente.

Integrazione dei dati
A causa del gran numero di analiti (ad esempio, citochine) misurati nel test Luminex, l’analisi dei dati può essere difficile da interpretare se ogni proteina quantificata viene analizzata individualmente. Per semplificare l’analisi e catturare le tendenze osservate tra gli analiti, utilizziamo un metodo di analisi multivariata chiamato regressione parziale dei minimi quadrati (PLSR, Figura 8)²³. PlSR funziona identificando un asse di pesi corrispondente a ciascuna proteina misurata (cioè citochine o fosfo-proteine, denominate “variabili predittive”) che insieme spiegano in modo ottimale la co-varianza delle proteine misurate con una variabile di risposta (ad esempio, flusso sanguigno cerebrale). I pesi sono indicati come “carichi” e sono assemblati in un vettore noto come variabile latente (LV). Proiettando (indicato come “punteggio”) i dati proteici misurati su ciascuno dei due LV, i dati possono essere ritracciati in termini di questi LV. Dopo aver calcolato il PLSR, utilizziamo una rotazione varimax per identificare un nuovo LV che massimizza la covarianza tra le proiezioni del campione sul LV e la variabile predittiva²⁴. Questo approccio ci consente di definire LV1 come l’asse per il quale viene spiegata al meglio la varianza della variabile di risposta. LV2 massimizza la co-varianza tra la variabile di risposta e i dati residui di LV1, che possono essere associati alla variabilità biologica o tecnica tra i campioni. Infine, conduciamo una Convalida incrociata Leave One Out (LOOCV) per garantire che il modello PLSR non dipenda fortemente da un campione²³.

In questo protocollo, dettagliamo i metodi per caratterizzare la risposta del tessuto neuroinfiammatorio ed emodinamico a mTBI. Il flusso di lavoro generale è descritto nella Figura 1. In questo protocollo, i topi sono soggetti a uno o più mTBI utilizzando un modello di trauma cranico chiuso a goccia di peso. Il flusso sanguigno cerebrale viene misurato longitudinalmente prima e in più punti temporali dopo l’infortunio. Nel momento di interesse per l’interrogazione dei cambiamenti neuroinfiammatori, l’animale viene eutanasia e il cervello viene estratto. Le regioni cerebrali di interesse sono isolate tramite microdissezione e quindi lisate per estrarre proteine. I lisati vengono quindi utilizzati sia per i saggi immunologici multiplexati Luminex di espressione di citochine e fosfoproteine, sia per Western blot. Infine, questo set di dati olistico è integrato utilizzando un’analisi di regressione parziale dei minimi quadrati.