ניתוח מערכות של התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית קלה ולשילוב נתונים אלה כחלק מניתוח מערכות רב-משתניות תוך שימוש ברגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים.
Abstract
פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) הן בעיה משמעותית בבריאות הציבור. חשיפה חוזרת ונשנית ל-mTBI עלולה להוביל לליקויים תפקודיים מצטברים ועמידים לאורך זמן. מחקרים רבים של הקבוצה שלנו ושל אחרים הראו כי mTBI מגרה ביטוי ציטוקינים ומפעיל מיקרוגליה, מפחית את זרימת הדם המוחי ואת חילוף החומרים, ופוגע בתגובתיות כלי הדם במוח. יתר על כן, מספר עבודות דיווחו על קשר בין derangements בסמנים נוירו-דלקתיים והמודינמיים אלה לבין ליקויים קוגניטיביים. כאן נפרט שיטות לאפיון תגובת הרקמה הנוירו-דלקתית וההמודינמית ל-mTBI בעכברים. באופן ספציפי, אנו מתארים כיצד לבצע מודל ירידת משקל של mTBI, כיצד למדוד באופן אורכי את זרימת הדם במוח באמצעות טכניקה אופטית לא פולשנית הנקראת ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר, וכיצד לבצע בדיקה חיסונית מרובת Luminex על דגימות רקמת מוח כדי לכמת ציטוקינים וחלבוני פוספו-חלבונים אימונומודולטוריים (למשל, בתוך מסלולי MAPK ו- NFκB) המגיבים ומווסתים את הפעילות של מיקרוגליה ותאי חיסון עצביים אחרים. לבסוף, אנו מפרטים כיצד לשלב נתונים אלה באמצעות גישת ניתוח מערכות רב משתניות כדי להבין את הקשרים בין כל המשתנים הללו. הבנת הקשרים בין משתנים פיזיולוגיים ומולקולריים אלה תאפשר לנו בסופו של דבר לזהות מנגנונים האחראים על mTBI.
Introduction
סקירה
פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) משפיעות על כ-1.6-3.8 מיליון ספורטאים בשנה1. פציעות אלה, כולל פגיעות תת-זעזוע מוח וזעזוע מוח, עלולות להותיר את המטופלים עם תסמינים פיזיים, רגשיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים חולפים2. יתר על כן, mTBI חוזר (rmTBI) מתמשך בתוך “חלון של פגיעות” יכול להוביל לחומרה מצטברת ולמשך של השלכות קוגניטיביות שנמשכות זמן רב יותר מההשפעות של mTBI יחיד בלבד3, ובסופו של דבר אפילו לאובדן קבוע של תפקוד 4,5,6. למרות שחולים רבים מחלימים תוך פרק זמן קצר יחסית ( חודש אחד, כאשר חלקם נמשכים עד שנה 3,7,8,9. למרות השכיחות הגבוהה וההשלכות המתמשכות של פציעות אלה, מנגנוני הפציעה אינם מובנים היטב ואין אסטרטגיות טיפול יעילות.
בהתחשב בשונות הגבוהה בתוצאות לאחר mTBI/rmTBI, אחד האתגרים בזיהוי טריגרים מולקולריים בשלב מוקדם מרקמה המתקבלים במחקרי mTBI/rmTBI סופניים הוא היעדר נתונים אורכיים המדגימים “קשרים מולקולריים חריפים” סופיים של טריגרים מולקולריים אלה לתוצאות ארוכות טווח יותר. כדי להתגבר על האתגר הזה, הקבוצה שלנו גילתה שזרימת דם מוחית מופחתת באופן חריף שנמדדה באופן חריף באמצעות כלי אופטי שנקרא ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר (DCS), מתואמת מאוד עם תוצאה קוגניטיבית ארוכת טווח יותר במודל עכבר של rmTBI10. באמצעות סמן ביולוגי המודינמי זה, הראינו כי לעכברים עם זרימת דם מוחית נמוכה באופן חריף (ובהרחבה, לתוצאה ארוכת טווח חזויה גרועה יותר) יש עליות חריפות במקביל באיתות פוספו עצבי הן במסלולי MAPK והן במסלולים NFκB, עלייה בביטוי העצבי של ציטוקינים פרו-דלקתיים, ועליות בביטוי של הסמן הפאגוציטים/מיקרוגליאליים Iba111 . נתונים אלה מצביעים על תפקיד אפשרי לאיתות פוספו-איתות עצבי, ביטוי ציטוקינים והפעלה מיקרוגליאלית הן בוויסות החריף של זרימת הדם במוח לאחר הפגיעה והן בהפעלת מפל איתות שמוביל לתפקוד לקוי של מערכת העצבים ולתוצאה קוגניטיבית גרועה יותר. להלן, אנו מפרטים את הגישה שלנו לחקור בו זמנית הן את הסביבה ההמודינמית והן את הסביבה הנוירו-דלקתית לאחר rmTBI וכיצד לשלב את מערכי הנתונים המורכבים הללו. באופן ספציפי, אנו מתארים נהלים לארבעה שלבים מרכזיים לגישה מקיפה זו: (1) מודל ירידת משקל של פגיעה מוחית טראומטית קלה, (2) הערכה של זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת, (3) כימות של הסביבה הנוירו-דלקתית, ו-(4) שילוב נתונים (איור 1). להלן, אנו מספקים מבוא קצר לכל אחד מהשלבים המרכזיים הללו כדי לעזור להנחות את הקוראים דרך הרציונל שמאחורי השיטות שלנו. שארית כתב היד מספקת פרוטוקול מפורט לכל אחד מהשלבים המרכזיים הללו.
מודל ירידת משקל של פגיעה מוחית טראומטית קלה
למרות שמודלים פרה-קליניים מצוינים רבים של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת על עצמה קיימים 12,13,14,15,16,17,18, אנו משתמשים במודל מבוסס ורלוונטי מבחינה קלינית של פגיעת ראש סגורה עם ירידת משקל. המאפיינים העיקריים של מודל זה כוללים (1) השפעה קהה של הגולגולת/הקרקפת השלמה ואחריה סיבוב בלתי מוגבל של הראש סביב הצוואר, (2) ללא פגיעה מוחית מבנית גלויה, בצקת, נזק למחסום דם-מוח, מוות חריף בתאים או אובדן כרוני של רקמת המוח, ו-(3) ליקויים קוגניטיביים מתמשכים (עד שנה) המופיעים רק לאחר פגיעות מרובות19 (איור 2).
הערכת זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת
ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר (DCS) היא טכניקה אופטית לא פולשנית המודדת את זרימת הדם 5,20,21. ב- DCS, מקור אור אינפרה-אדום קרוב ממוקם על משטח הרקמה. גלאי ממוקם במרחק קבוע מהמקור על פני השטח של הרקמה כדי לזהות אור שהתפזר ברקמה (איור 3). פיזור תאי דם אדומים נעים גורם לעוצמת האור שזוהתה להשתנות עם הזמן. מודל אנליטי פשוט המכונה תאוריית דיפוזיית המתאם משמש כדי לקשר את תנודות העוצמה האלה למדד של זרימת הדם (CBFi, איור 4). למרות שיחידות ה-CBFi (ס”מ2/s) אינן יחידות הזרימה המסורתיות (mL/min/100 g), מחקר קודם שנערך בעכברים הראה כי CBFi נמצא בקורלציה חזקה לזרימת דם מוחית הנמדדת על ידי ספין עורקי שכותרתו MRI21.
לשם השוואה, מכשיר ה- DCS המשמש כאן נבנה בתוך הבית והוא מורכב מלייזר באורך קוהרנטיות באורך 852 ננומטר, מערך של 4 פוטודיודות מפולת ספירת פוטונים, ולוח מתאם אוטומטי בחומרה (טאו יחיד, 8 ערוצים, 100 ns זמן דגימה מינימלי)21,22. הנתונים נרכשים באמצעות תוכנה תוצרת בית שנכתבה ב- LabView. ממשק החיות של המכשיר מורכב מסיבי מקור מרובי-מודים של 400 מיקרומטר (טווח אורכי גל של 400-2200 ננומטר, ליבת סיליקה טהורה, חיפוי קשיח של TECS) וסיבי גל של 780 ננומטר במצב יחיד (טווח אורכי גל של 780-970 ננומטר, ליבת סיליקה טהורה, חיפוי קשיח של TECS, 730 ± 30 ננומטר ניתוק מצב שני) במרווחים של 6 מ”מ זה מזה ומוטמעים בחיישן שחור מודפס בתלת-ממד (4 מ”מ x 8 מ”מ, איור 3).
כימות הסביבה הנוירו-דלקתית
אף על פי שדלקת עצבית מווסתת על ידי תהליכים תאיים מגוונים, שני מנגנונים רלוונטיים מרכזיים הם איתות חוץ-תאי על ידי ציטוקינים/כימוקינים ואיתות תוך-תאי על-ידי חלבוני פוספו. כדי לחקור את הסביבה הנוירו-דלקתית של המוח לאחר פגיעה, המוחות מופקים מעכברים, מיקרו-דיסקים, וציטוקינים/כימוקינים וחלבוני פוספו-חלבונים מכמתים באמצעות Luminex (איור 5, איור 6, איור 7). בדיקות אימונו-אסות משולבות של Luminex מאפשרות כימות סימולטני של אוסף מגוון של חלבונים אלה על-ידי צימוד של בדיקות אימונו-סורבנטיות הקשורות לאנזים (ELISAs) לחרוזים מגנטיים המתויגים באופן פלואורסצנטי. תגים פלואורסצנטיים מובהקים משמשים עבור כל חלבון בעל עניין, וחרוזים של כל תג מתפקדים עם נוגדן לכידה כנגד אותו חלבון מסוים. מאות חרוזים ללכידת כל חלבון מעורבבים יחד, מונחים בצלחת 96 באר, ודגירה עם דגימה. לאחר הדגירה לדוגמה, נעשה שימוש במגנט כדי ללכוד את החרוזים בבאר בזמן שהדגימה נשטפת החוצה. לאחר מכן, נוגדן לזיהוי ביוטינילציה נקשר לאנליט המעניין כדי ליצור כריך נוגדן-אנטיגן הדומה ל-ELISA מסורתי, אך כאשר ה-ELISA עבור כל חלבון מופיע על חרוז אחר המתויג באופן פלואורסצנטי. הוספת סטרפטווידין מצומד לפיקואריתרין (SAPE) משלימה כל תגובה. לאחר מכן, מכשיר לומינקס קורא את החרוזים ומפריד את האות לפי כל תג/חלבון פלואורסצנטי.
שילוב נתונים
בגלל המספר הגדול של אנליטים (למשל, ציטוקינים) שנמדדו במבחן לומינקס, ניתוח נתונים יכול להיות קשה לפענוח אם כל חלבון מכמת מנותח בנפרד. כדי לפשט את הניתוח וללכוד מגמות שנצפו בקרב אנליטים, אנו משתמשים בשיטת ניתוח רב-משתנית הנקראת רגרסיה של ריבועים מזעריים חלקיים (PLSR, איור 8)23. PLSR פועל על ידי זיהוי ציר של משקלים המתאימים לכל חלבון שנמדד (כלומר, ציטוקינים או חלבוני פוספו, המכונים “משתנים מנבאים”) המסבירים יחד בצורה אופטימלית את השונות המשותפת של החלבונים שנמדדו עם משתנה תגובה (למשל, זרימת דם מוחית). המשקולות מכונות “טעינות” ומורכבות לווקטור המכונה משתנה סמוי (LV). על ידי הקרנת (המכונה “ניקוד”) של נתוני החלבון הנמדדים על כל אחד משני רכבי LVs, ניתן להתוות מחדש את הנתונים במונחים של רכבי LVs אלה. לאחר חישוב ה-PLSR, אנו משתמשים בסיבוב varimax כדי לזהות LV חדש שממקסם את השונות המשותפת בין תחזיות המדגם ל-LV ולמשתנה המנבא24. גישה זו מאפשרת לנו להגדיר את LV1 כציר שעבורו מוסברת השונות הטובה ביותר של משתנה התגובה. LV2 ממקסם את השונות המשותפת בין משתנה התגובה לבין הנתונים השיוריים של LV1, שעשויים להיות קשורים לשונות ביולוגית או טכנית בין דגימות. לבסוף, אנו מבצעים אימות Cross Leave One Out (LOOCV) כדי להבטיח שמודל PLSR אינו תלוי במידה רבה בדגימה אחת23.
בפרוטוקול זה, אנו מפרטים שיטות לאפיון תגובת הרקמה הנוירו-דלקתית וההמודינמית ל-mTBI. זרימת העבודה הכללית מתוארת באיור 1. בפרוטוקול זה, עכברים כפופים ל-mTBIs אחד או יותר באמצעות מודל של פגיעת ראש סגורה עם ירידה במשקל. זרימת הדם המוחית נמדדת לאורך לפני ובמספר נקודות זמן לאחר הפציעה. בנקודת הזמן של עניין לחקירת שינויים נוירו-דלקתיים, החיה מורדמת, והמוח מופק. אזורים מעניינים במוח מבודדים באמצעות מיקרו-דיסקציה ואז משקרים אותם כדי לחלץ חלבון. לאחר מכן משתמשים ב-Lysates הן עבור אימונו-אסים מרובבים של Luminex של ציטוקינים וביטוי פוספו-חלבון והן עבור כתם מערבי. לבסוף, מערך נתונים הוליסטי זה משולב באמצעות ניתוח רגרסיה חלקי של ריבועים לפחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נפרט שיטות להערכת התגובה ההמודינמית והנוירו-דלקתית לפגיעה מוחית טראומטית קלה שחוזרת על עצמה. יתר על כן, הראינו כיצד לשלב נתונים אלה כחלק מניתוח מערכות רב משתניות באמצעות רגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים. בטקסט שלהלן נדון בכמה מהשלבים והמגבלות המרכזיים הקשורים לפרוטוקול, כמו גם ביתרונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R21 NS104801 (EMB) ו- R01 NS115994 (LBW/EB) ופרס ממוקד של סגל זוטר של אטלנטה לבריאות ילדים (EMB). עבודה זו נתמכה גם על ידי משרד ההגנה האמריקאי באמצעות תוכניות המחקר הרפואי בהנחיית הקונגרס תחת פרס מספר. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחבר ואינן בהכרח מאושרות על ידי משרד ההגנה. חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי תוכנית עמיתי המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס ‘ 1937971. כל הדעות, הממצאים והמסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את דעותיה של הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
