Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Overzicht
Mild traumatisch hersenletsel (mTBIs) impact ~ 1,6-3,8 miljoen atleten per jaar¹. Deze verwondingen, waaronder sub-hersenschudding en hersenschudding, kunnen patiënten achterlaten met voorbijgaande fysieke, emotionele, psychologische en cognitieve symptomen². Bovendien kan repetitieve mTBI (rmTBI) binnen een “venster van kwetsbaarheid” leiden tot cumulatieve ernst en duur van cognitieve gevolgen die langer duren dan de effecten van een enkele mTBI alleen³, en uiteindelijk zelfs tot permanent verlies van functie ^4,5,6. Hoewel veel patiënten binnen een relatief kort tijdsbestek ( 1 maand, waarvan sommige tot 1 jaar^duren 3,7,8,9. Ondanks de hoge prevalentie en blijvende gevolgen van deze verwondingen, zijn letselmechanismen slecht begrepen en bestaan er geen effectieve behandelingsstrategieën.

Gezien de hoge variabiliteit in uitkomsten na mTBI/rmTBI, is een uitdaging bij het identificeren van moleculaire triggers in een vroeg stadium van weefsel verkregen in terminale mTBI/rmTBI-studies het gebrek aan longitudinale gegevens die definitieve “acute moleculaire verbanden” van deze moleculaire triggers met resultaten op langere termijn aantonen. Om deze uitdaging te overwinnen, heeft onze groep ontdekt dat een acuut verminderde cerebrale bloedstroom, acuut gemeten met behulp van een optisch hulpmiddel genaamd diffuse correlatiespectroscopie (DCS), sterk correleert met cognitieve resultaten op langere termijn in een muismodel van rmTBI¹⁰. Met behulp van deze hemodynamische biomarker toonden we aan dat muizen met een acuut lage cerebrale bloedstroom (en, bij uitbreiding, slechter voorspelde langetermijnresultaten) gelijktijdige acute toenames hebben in neuronale fosfo-signalering binnen zowel MAPK- als NFκB-routes, toename van neuronale expressie van pro-inflammatoire cytokines en toename van expressie van de fagocyt / microgliale marker Iba1¹¹ . Deze gegevens suggereren een mogelijke rol voor neuronale fosfo-signalering, cytokine-expressie en microgliale activering in zowel de acute regulatie van cerebrale bloedstroom na letsel als bij het activeren van een signaalcascade die leidt tot neuronale disfunctie en slechtere cognitieve resultaten. Hierin beschrijven we onze aanpak om tegelijkertijd zowel de hemodynamische als neuro-inflammatoire omgeving na rmTBI te onderzoeken en hoe deze complexe datasets te integreren. In het bijzonder schetsen we procedures voor vier belangrijke stappen in deze alomvattende aanpak: (1) een weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel, (2) beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie, (3) kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving en (4) gegevensintegratie (figuur 1). Hieronder geven we een korte inleiding tot elk van deze belangrijke stappen om lezers te helpen bij het doorlopen van de redenering achter onze methoden. De rest van het manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor elk van deze belangrijke stappen.

Weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel
Hoewel er veel uitstekende preklinische modellen van repetitieve milde TBI bestaan 12,13,14,15,16,17,18, gebruiken we een goed ingeburgerd en klinisch relevant weight-drop gesloten hoofdletselmodel. Belangrijke kenmerken van dit model zijn (1) stompe impact van de intacte schedel / hoofdhuid gevolgd door onbeperkte rotatie van het hoofd rond de nek, (2) geen openlijk structureel hersenletsel, oedeem, schade aan de bloed-hersenbarrière, acute celdood of chronisch hersenweefselverlies, en (3) aanhoudende (tot 1 jaar) cognitieve tekorten die pas na meerdere treffers¹⁹ optreden (figuur 2).

Beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie
Diffuse correlatiespectroscopie (DCS) is een niet-invasieve optische techniek die de bloedstroom^{meet 5,20,21}. Bij DCS wordt een nabij-infrarode lichtbron op het weefseloppervlak geplaatst. Een detector wordt op een vaste afstand van de bron op het weefseloppervlak geplaatst om licht te detecteren dat zich heeft vermenigvuldigd verspreid door het weefsel (figuur 3). Verstrooiing van bewegende rode bloedcellen zorgt ervoor dat de gedetecteerde lichtintensiteit met de tijd fluctueert. Een eenvoudig analytisch model dat bekend staat als correlatiediffusietheorie wordt gebruikt om deze intensiteitsfluctuaties te relateren aan een index van de bloedstroom (CBF_i, figuur 4). Hoewel de eenheden van CBF_i (cm²/s) niet de traditionele stroomeenheden zijn (ml/min/100 g), heeft een eerdere studie bij muizen aangetoond dat CBF_i sterk correleert met de cerebrale bloedstroom gemeten door arteriële spin met het label MRI²¹.

Ter referentie, het DCS-instrument dat hier wordt gebruikt, is in eigen huis gebouwd en bestaat uit een 852 nm lange coherentie-lengtelaser, een array van 4 fotonen die lawinefotodiodes tellen en een hardware autocorrelatorbord (enkele tau, 8-kanaals, 100 ns minimale monstertijd)^21,22. Gegevens worden verkregen met zelfgemaakte software geschreven in LabView. De dierlijke interface voor het apparaat bestaat uit een 400 μm multimode bronvezel (400-2200 nm golflengtebereik, pure silicakern, TECS Hard Cladding) en een 780 nm single mode detector fiber (780-970 nm golflengtebereik, pure silica core, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm second mode cut-off) op 6 mm afstand van elkaar en ingebed in een zwarte 3D-geprinte sensor (4 mm x 8 mm, Figuur 3).

Kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving
Hoewel neuro-inflammatie wordt gereguleerd door diverse cellulaire processen, zijn twee belangrijke relevante mechanismen extracellulaire signalering door cytokines / chemokines en intracellulaire signalering door fosfo-eiwitten. Om de neuro-inflammatoire omgeving van de hersenen na het letsel te onderzoeken, worden hersenen geëxtraheerd uit muizen, gemicrodisseceerd en cytokines / chemokines en fosfo-eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van Luminex (figuur 5, figuur 6, figuur 7). Luminex multiplexed immunoassays maken gelijktijdige kwantificering van een diverse verzameling van deze eiwitten mogelijk door enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA’s) te koppelen aan fluorescerend gelabelde magnetische kralen. Verschillende fluorescerende tags worden gebruikt voor elk eiwit van belang, en kralen van elke tag worden gefunctionaliseerd met een capture-antilichaam tegen dat specifieke eiwit. Honderden kralen voor het vangen van elk eiwit worden gemengd, in een 96-putplaat geplaatst en geïncubeerd met monster. Na monsterincubatie wordt een magneet gebruikt om de kralen in de put te vangen terwijl het monster wordt uitgewassen. Vervolgens bindt gebiotinyleerd detectieantilichaam zich aan de analyt van belang om een antilichaam-antigeensandwich te vormen dat vergelijkbaar is met een traditionele ELISA, maar met de ELISA voor elk eiwit dat op een andere fluorescerend gelabelde kraal voorkomt. Het toevoegen van fycoerythrin-geconjugeerde streptavidin (SAPE) voltooit elke reactie. Het Luminex-instrument leest vervolgens de kralen en scheidt het signaal volgens elke fluorescerende tag / eiwit.

Data-integratie
Vanwege het grote aantal analyten (bijvoorbeeld cytokines) gemeten in de Luminex-test, kan data-analyse moeilijk te interpreteren zijn als elk gekwantificeerd eiwit afzonderlijk wordt geanalyseerd. Om de analyse te vereenvoudigen en trends tussen analyten vast te leggen, gebruiken we een multivariate analysemethode genaamd partial least squares regression (PLSR, Figuur 8)²³. PLSR werkt door het identificeren van een as van gewichten die overeenkomen met elk gemeten eiwit (d.w.z. cytokines of fosfo-eiwitten, aangeduid als “predictorvariabelen”) die samen de co-variantie van de gemeten eiwitten met een responsvariabele (bijv. Cerebrale bloedstroom) optimaal verklaren. De gewichten worden “belastingen” genoemd en worden samengevoegd tot een vector die bekend staat als een latente variabele (LV). Door de gemeten eiwitgegevens op elk van de twee LP’s te projecteren (aangeduid als “scoring”), kunnen de gegevens opnieuw worden uitgezet in termen van deze LVs. Na het berekenen van de PLSR gebruiken we een varimax-rotatie om een nieuwe LV te identificeren die de covariantie tussen de monsterprojecties op de LV en de predictorvariabele²⁴ maximaliseert. Deze benadering stelt ons in staat om LV1 te definiëren als de as waarvoor de variantie van de responsvariabele het best kan worden verklaard. LV2 maximaliseert de co-variantie tussen de responsvariabele en LV1-restgegevens, die kunnen worden geassocieerd met biologische of technische variabiliteit tussen monsters. Ten slotte voeren we een Leave One Out Cross Validation (LOOCV) uit om ervoor te zorgen dat het PLSR-model niet sterk afhankelijk is van één monster²³.

In dit protocol beschrijven we methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische weefselrespons op mTBI te karakteriseren. De algemene workflow wordt beschreven in figuur 1. In dit protocol worden muizen onderworpen aan een of meer mTBIs met behulp van een gewichtsdruppel gesloten hoofdletselmodel. De cerebrale bloedstroom wordt in de lengterichting gemeten voor en op meerdere tijdstippen na het letsel. Op het moment van interesse voor ondervraging van neuro-inflammatoire veranderingen, wordt het dier geëuthanaseerd en worden de hersenen geëxtraheerd. Hersengebieden van belang worden geïsoleerd via microdissectie en vervolgens gelyseerd om eiwit te extraheren. Lysaten worden vervolgens gebruikt voor zowel Luminex multiplexed immunoassays van cytokine en fosfo-eiwit expressie als Western blot. Ten slotte wordt deze holistische dataset geïntegreerd met behulp van een partiële kleinste kwadratenregressieanalyse.