Пациент-производные Ксенотрансплантат Модель для венозной мальформации
Summary
Мы представляем подробный протокол для создания murine xenograft модель венозной мальформации. Эта модель основана на подкожной инъекции эндотелиальных клеток, полученных пациентом, содержащих гиперактивные мутации генов TIE2 и/или PIK3CA. Поражения ксенотрансплантата тесно резюмируют гистопатологические особенности ткани пациента VM.
Abstract
Венозная мальформация (ВМ) является сосудистой аномалией, которая возникает в результате нарушения развития венозной сети, что приводит к расширенным и часто дисфункциональным венам. Цель этой статьи состоит в том, чтобы тщательно описать создание модели ксенотрансплантата murine, которая имитирует человеческий VM и способна отражать неоднородность пациента. Гиперактивные ненаследуемые (соматические) мутации ТЭК (TIE2) и ПИК3КА в эндотелиальных клетках (ЭК) определены в качестве основных факторов расширения патологических сосудов в ВМ. В следующем протоколе описывается изоляция, очистка и расширение ЕК, полученной пациентом, выражают мутант TIE2 и/или PIK3CA. Эти EC вводятся подкожно в спину иммунодефицитных атимических мышей для генерации эктатических сосудистых каналов. Поражения, генерируемые TIE2 или PIK3CA-мутантом EC, заметно сосудизируются в течение 7-20129 дней после инъекции и подытося гистопатологические особенности ткани пациента VM. Эта модель Ксенотрансплантата VM обеспечивает надежную платформу для исследования клеточных и молекулярных механизмов, движущих образованием и расширением VM. Кроме того, эта модель будет иметь важное значение для трансляционных исследований тестирования эффективности новых кандидатов наркотиков в предотвращении аномального расширения сосудов видели в человеке VM.
Introduction
Дефекты в развитии сосудов являются основной причиной многих заболеваний, включая венозную мальформацию (ВМ). ВМ является врожденным заболеванием, характеризующимся аномальным морфогенезом и расширениемвен 1. Важные исследования на ткани VM и эндотелиальных клеток (EC) определили усиления функции мутаций в двух генах: ТЭК, который кодирует рецептор тирозинкиназы TIE2, и PIK3CA, который кодирует p110 “(каталитический субъединица) изоформ PI3-киназы (PI3K)2,3,4.5 Эти соматические мутации приводят к лиганд-независимой гипер-активации ключевых ангиогенных/рост сигнальных путей, включая PI3K/AKT, что приводит к расширенным эстатическимвенам 3. Несмотря на эти важные генетические открытия, последующие клеточные и молекулярные механизмы, запускающие аномальный ангиогенез и образование увеличенных сосудистых каналов, до сих пор не до конца изучены.
Во время нормального и патологического ангиогенеза, новые сосуды прорастают из уже существующей сосудистой сети и EC проходят последовательность важных клеточных процессов, включая пролиферацию, миграцию, внеклеточную матрицу (ECM) ремоделирование и образованиелюмена 6. Двух- и трехмерные (2D/3D) культуры in vitro EC являются важными инструментами для исследования каждого из этих клеточных свойств в отдельности. Тем не менее, существует явный спрос на модель мыши, резюмируемую расширение патологических сосудов в рамках микроокноронности хозяина, обеспечивая при этом эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов для трансляционных исследований.
До настоящего времени не сообщалось о трансгенной модели murine VM, связанной с мутациями усиления функции TIE2. Текущие трансгенные модели мышей VM опираются на повсеместное или ограниченное в тканях выражение активизировавшейся мутации PIK3CA p.H1047R3,5. Эти трансгенные животные дают значительное представление о воздействии этой мутации PIK3CA на все тело или ткани. Ограничением этих моделей является формирование высоко патологической сосудистой сети, приводящей к ранней летальности. Таким образом, эти мышиные модели не в полной мере отражают спорадическое возникновение мутационных явлений и локализованный характер патологии ВМ.
Напротив, модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, основаны на трансплантации или инъекции патологических тканей или клеток, полученных от пациентов в иммунодефицитныхмышей 7. Ксенотрансплантат модели являются мощным инструментом для расширения знаний о развитии болезни и открытие новых терапевтическихагентов 8. Кроме того, использование клеток, полученных пациентами, позволяет ученым резюмировать неоднородность мутаций для изучения спектра фенотипов пациентов.
Здесь мы описываем протокол, в котором полученные пациентом VM EC, которые выражают мутант constitutively-активную форму TIE2 и/или PIK3CA вводятся подкожно в задней части атимических обнаженных мышей. Инъекционные сосудистые клетки подвешиваются в рамках ЭКМ для содействия ангиогенезу, как описано в предыдущих сосудистых моделях ксенотрансплантата9,,10,,11. Эти ВМ EC проходят значительный морфогенез и генерируют увеличенные, проникнутые патологические сосуды при отсутствии поддерживающих клеток. Описанная ксенотрансплантатная модель ВМ обеспечивает эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов на их способность препятствовать неконтролируемому расширению люмена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод создания ксенотрансплантатной модели VM, полученной пациентом. Эта модель murine представляет отличную систему, которая позволяет исследователям получить более глубокое понимание расширения патологического люмена и будет играть важную роль в разработке более э?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Нора озер для корректирования. Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом сердца, легких и крови под номером R01 HL117952 (E.B.), в составе Национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
