Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa
Summary
Apresentamos um protocolo detalhado para gerar um modelo de xenoenxerto murine de malformação venosa. Este modelo é baseado na injeção subcutânea de células endoteliais derivadas do paciente contendo mutações genéticas TIE2 e/ou PIK3CA hiperativantes. As lesões de xenoenxerto recapitulam de perto as características histopatológicas do tecido do paciente VM.
Abstract
A malformação venosa (VM) é uma anomalia vascular que surge do desenvolvimento prejudicado da rede venosa resultando em veias dilatadas e muitas vezes disfuncionais. O objetivo deste artigo é descrever cuidadosamente o estabelecimento de um modelo de xenoenxerto murina que imita vm humano e é capaz de refletir a heterogeneidade do paciente. Mutações não herdadas (somáticas) TEK (TIE2) e PIK3CA hiperativas em células endoteliais (CE) foram identificadas como os principais condutores do alargamento de vasos patológicos em VM. O protocolo a seguir descreve o isolamento, purificação e expansão da CE derivada do paciente expressando tie2 mutante e/ou PIK3CA. Estes CE são injetados subcutâneamente na parte de trás de camundongos atímicos imunodeficientes para gerar canais vasculares ectáticos. As lesões geradas com TIE2 ou PIK3CA-mutante EC são visivelmente vascularizadas dentro de 7\u20129 dias após a injeção e recapitulam características histopatológicas do tecido do paciente VM. Este modelo de xenergrafto VM fornece uma plataforma confiável para investigar os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a formação e expansão de VM. Além disso, este modelo será fundamental para estudos translacionais que testam a eficácia de novos candidatos a medicamentos na prevenção do alargamento anormal de vasos vistos em VM humano.
Introduction
Defeitos no desenvolvimento da vasculatura são a causa básica de muitas doenças, incluindo a malformação venosa (VM). VM é uma doença congênita caracterizada por morfogênese anormal e expansão das veias1. Estudos importantes sobre tecido VM e células endoteliais (CE) identificaram mutações de ganho de função em dois genes: TEK, que codifica o receptor de quinase tiesina TIE2, e PIK3CA, que codifica o isóforme p110α (subunidade catalítica) de PI3-kinase (PI3K)2,3,,4,5. Essas mutações somáticas resultam em hiperativação independente de ligante das principais vias de sinalização angiogênica/de crescimento, incluindo PI3K/AKT, resultando assim em veias ectáticas dilatadas3. Apesar dessas importantes descobertas genéticas, os mecanismos celulares e moleculares subsequentes que desencadeiam angiogênese anormal e a formação de canais vasculares ampliados ainda não são totalmente compreendidos.
Durante a angiogênese normal e patológica, novos vasos brotam de uma rede vascular pré-existente e a CE passa por uma sequência de processos celulares importantes, incluindo proliferação, migração, remodelação de matriz extracelular (ECM) e formação de lúmen6. Culturas in vitro in vitro de duas e tridimensionais (2D/3D) da CE são ferramentas importantes para investigar cada uma dessas propriedades celulares individualmente. No entanto, há uma clara demanda por um modelo de mouse recapitulando o alargamento de vasos patológicos dentro do microambiente hospedeiro, ao mesmo tempo em que fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para pesquisa translacional.
Até o momento, não foi relatado um modelo de murina transgênica de VM associado às mutações de ganho de função TIE2. Os modelos atuais de camundongos VM transgênicos dependem da expressão onipresente ou restrita ao tecido da mutação ativante PIK3CA p.H1047R3,5. Esses animais transgênicos fornecem uma visão significativa sobre efeitos específicos do corpo inteiro ou tecido desta mutação PIK3CA hotspot. A limitação desses modelos é a formação de uma rede vascular altamente patológica resultando em letalidade precoce. Assim, esses modelos de camundongos não refletem totalmente a ocorrência esporádica de eventos mutacionais e a natureza localizada da patologia VM.
Pelo contrário, os modelos de xenoenxerto derivados do paciente baseiam-se no transplante ou injeção de tecido patológico ou células derivadas de pacientes em camundongos imunodeficientes7. Os modelos de xenoenxerto são uma poderosa ferramenta para ampliar o conhecimento sobre o desenvolvimento de doenças e a descoberta de novos agentes terapêuticos8. Além disso, o uso de células derivadas do paciente permite que os cientistas recapitulem a heterogeneidade da mutação para estudar o espectro de fenótipos do paciente.
Aqui, descrevemos um protocolo onde vm ec derivados do paciente que expressam uma forma mutante constitutivamente ativa de TIE2 e/ou PIK3CA são injetados subcutâneamente na parte de trás de ratos nus atímicos. As células vasculares injetadas estão suspensas em uma estrutura de ECM, a fim de promover a angiogênese, conforme descrito nos modelos anteriores de xenoenxerto vascular9,,10,,11. Estes VM EC sofrem morfogênese significativa e geram vasos patológicos ampliados e perfundidos na ausência de células de suporte. O modelo de xenoenxerto descrito de VM fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para sua capacidade de inibir a expansão de lúmen descontrolada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um método para gerar um modelo de xenoenxerto derivado do paciente de VM. Este modelo murino apresenta um excelente sistema que permite aos pesquisadores obter uma compreensão mais profunda do alargamento patológico do lúmen e será fundamental no desenvolvimento de terapias mais eficazes e direcionadas para o tratamento de VM. Isso pode ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares, como a malformação venosa linfática capilar16. Existem vár…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Nora Lakes pela revisão. A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute, sob o Prêmio Número R01 HL117952 (E.B.), parte dos Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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