静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル
Summary
静脈奇形のマウス異種移植片モデルを生成するための詳細なプロトコルを提示する。このモデルは、超活性化TIE2および/またはPIK3CA遺伝子変異を含む患者由来内皮細胞の皮下注射に基づいている。異種移植病変はVM患者組織の組織病理学的特徴を密接に再現する。
Abstract
静脈奇形(VM)は、拡張され、しばしば機能不全の静脈をもたらす静脈ネットワークの発達障害から生じる血管異常である。本稿の目的は、ヒトVMを模倣し、患者の異質性を反映することができるマウス異種移植片モデルの確立を慎重に説明することである。内皮細胞(EC)における非遺伝性(体性 )TEK(TIE2) および PIK3CA 突然変異を超活性化することは、VMにおける病理学的血管拡大の主な要因として同定されている。以下のプロトコルは、変異体TIE2および/またはPIK3CAを発現する患者由来ECの分離、精製および拡張について説明する。これらのECは、免疫不全性の高胸腺マウスの後部に皮下に注入され、神経血管チャネルを生成する。TIE2またはPIK3CA変異株ECで発生した病変は、VM患者組織の注射および再構成の7\u20129日以内に目に見えて血管化される。このVM異種移植モデルは、VMの形成と拡張を推進する細胞および分子メカニズムを調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。また、このモデルは、ヒトVMに見られる異常な血管拡大を防止する新規薬剤候補の有効性をテストする翻訳研究に役立つ。
Introduction
血管系の発達における欠陥は静脈奇形(VM)を含む多くの疾患の根本的な原因である。VMは、静脈の異常な形態形成および拡張を特徴とする先天性疾患である。VM組織および内皮細胞(EC)に関する重要な研究は、チロシンキナーゼ受容体TIE2をコードするTEKとPIK3CAの2つの遺伝子における機能獲得変異を同定2,3,4,した。これらの体細胞変異は、PI3K/AKTを含む主要な血管新生/増殖シグナル伝達経路のリガンド非依存性ハイパー活性化をもたらし、それによって拡張された拡張静脈3をもたらす。これらの重要な遺伝的発見にもかかわらず、異常な血管新生を引き起こすその後の細胞および分子メカニズムと拡大した血管チャネルの形成はまだ完全には理解されていない。
正常および病理学的血管新生の間に、既存の血管ネットワークおよびECから新しい血管が芽生える、増殖、移動、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよび管腔形成6を含む重要な細胞プロセスの配列を受ける。ECの2次元および3次元(2D/3D)インビトロ培養は、これらの細胞特性を個別に調査するための重要なツールです。それにもかかわらず、宿主微小環境内で病理学的血管の拡大を再現するマウスモデルの需要は明確であり、翻訳研究のための標的薬の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
最新の状態では、TIE2機能獲得変異に関連するVMのトランスジェニックマウスモデルは報告されていない。現在のトランスジェニックVMマウスモデルは、活性化変異PIK3CA p.H1047R p.H1047R33,55のユビキタスまたは組織制限発現に依存する。これらのトランスジェニック動物は、このホットスポットPIK3CA突然変異の全身または組織特異的な効果に関する重要な洞察を提供する。これらのモデルの限界は、初期致死をもたらす病理学的血管ネットワークの形成である。したがって、これらのマウスモデルは、突然変異事象の散発的な発生およびVM病理の局在的性質を完全に反映していない。
反対に、患者由来の異種移植片モデルは、患者由来の病理組織または細胞を免疫不全マウス7に移植または注入することに基づいている。異種移植片モデルは、疾患の発症と新しい治療薬8の発見に関する知識を広げるための強力なツールです。さらに、患者由来の細胞を使用すると、科学者は突然変異異質性を再現して患者の異型のスペクトルを研究することができます。
ここでは、アチミックヌードマウスの後ろに、TIE2および/またはPIK3CAの変異体を構成的に活性な形態を発現する患者由来VM ECを皮下に注入するプロトコルについて説明する。注入された血管細胞は、以前の血管異種移植片モデル9、10、1110に記載されているように血管新生9を促進するためにECMフレームワークに懸濁される。,11これらのVM ECは、重要な形態形成を受け、支持細胞の不在時に肥大した、浸透した病理学的血管を生成する。VMの記載された異種移植片モデルは、制御不能な内腔の膨張を阻害する能力に対する標的薬物の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、VMの患者由来異種移植片モデルを生成する方法について説明する。このマウスモデルは、研究者が病理学的ルーメンの拡大をより深く理解することを可能にする優れたシステムを提示し、VMの治療のためのより効果的で標的療法の開発に役立ちます。これは、毛細血管リンパ性静脈奇形16のような他のタイプの血管異常を調査するために容易に適応することができ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ノラ湖の校正に感謝したいと考えています。この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所の一部である賞番号R01 HL117952(E.B.)の下で、国立心臓、肺、血液研究所によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
