מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל קסנוגרפט murine של מום ורדי. מודל זה מבוסס על הזרקה תת עורית של תאים אנדותל נגזר המטופל המכיל HYPER-activating TIE2 ו / או מוטציות גן PIK3CA. נגעים Xenograft מקרוב לסיכום התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת חולה VM.
Abstract
מום ורידים (VM) היא אנומליה כלי דם הנובעת מהתפתחות לקויה של הרשת ורידים וכתוצאה מכך ורידים מורחבים ולעתים קרובות תפקודיים. מטרת מאמר זה היא לתאר בקפידה את הקמתו של מודל xenograft murine המחקה VM אנושי והוא מסוגל לשקף הטרוגניות המטופל. Hyper-activating לא בירושה (סומטי) TEK (TIE2) ומוטציות PIK3CA בתאי אנדותל (EC) זוהו כנהגים העיקריים של הגדלת כלי פתולוגיים ב VM. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד, הטיהור וההרחבה של EC הנגזר ממטופל המביעים מוטציה TIE2 ו/או PIK3CA. EC אלה מוזרקים תת עורית לתוך החלק האחורי של עכברים אתיים immunodeficient כדי ליצור ערוצים כלי דם אקטוטיים. נגעים שנוצרו עם TIE2 או PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר בתוך 7\u20129 ימים של הזרקה ולתווך מחדש תכונות היסטופתולוגיות של רקמת חולה VM. מודל VM xenograft זה מספק פלטפורמה אמינה לחקור את המנגנונים הסלולריים והמולקולריים המניעים היווצרות VM והרחבה. בנוסף, מודל זה יהיה אינסטרומנטלי עבור מחקרי תרגום בדיקת היעילות של מועמדים לסמים רומן במניעת הגדלת כלי חריג לראות VM האנושי.
Introduction
פגמים בהתפתחות כלי הדם הם הגורם הבסיסי למחלות רבות, כולל מום ורדי (VM). VM היא מחלה מולדת המאופיינת מורפוגנזה חריגה והרחבה של ורידים1. מחקרים חשובים על רקמת VM ותאי אנדותל (EC) זיהו מוטציות רווח-של-תפקוד בשני גנים: TEK, אשר מקודד את קולטן קינאז טירוסין TIE2, ו PIK3CA, אשר מקודד p110α (תת-יחידת קטליטית) איזופורם של PI3-kinase (PI3K)2,,3,,4,,5. מוטציות סומטיות אלה לגרום היפר-הפעלה עצמאית ליגנד של מסלולי איתות אנגיוגני/צמיחה מפתח, כולל PI3K / AKT, וכתוצאה מכך ורידים אקתטייםמורחבים 3. למרות תגליות גנטיות חשובות אלה, המנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבאים המפעילים אנגיוגנזה חריגה והיווצרות של ערוצי כלי דם מוגדלים עדיין אינם מובנים במלואם.
במהלך אנגיוגנזה רגילה ופתולוגית, כלי חדשים צומחים מרשת כלי דם קיימת מראש ו-EC עוברים רצף של תהליכים תאיים חשובים כולל התפשטות, הגירה, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית (ECM) והווצרות לומן6. שניים ותלת מימדיים (2D/3D) בתרבויות המבחנה של EC הם כלים חשובים לחקור כל אחד ממאפייני הסלולר האלה בנפרד. אף על פי כן, יש דרישה ברורה עבור מודל העכבר recapitulating הרחבת כלי פתולוגי בתוך microenvironment המארח תוך מתן פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קלינית של תרופות ממוקדות למחקר תרגום.
עד כה, מודל murine transgenic של VM המשויך TIE2 רווח של פונקציה מוטציות לא דווח. מודלים הנוכחיים עכבר VM transgenic להסתמך על הביטוי בכל מקום או רקמה מוגבלת של המוטציה הפעלת PIK3CA p.H1047R3,5. בעלי חיים טרנסגנים אלה מספקים תובנה משמעותית על כל הגוף או רקמה ספציפית השפעות של מוטציה PIK3CA נקודה חמה זו. המגבלה של מודלים אלה היא היווצרות של רשת כלי דם פתולוגית מאוד וכתוצאה מכך קטלניות מוקדמת. לפיכך, מודלים אלה של העכבר אינם משקפים באופן מלא את המופע הספורדי של אירועי מוטציה ואופי מקומי של פתולוגיית VM.
להיפך, מודלים xenograft נגזר המטופל מבוססים על השתלה או הזרקה של רקמה פתולוגית או תאים נגזר מחולים לעכברים immunodeficient7. מודלים Xenograft הם כלי רב עוצמה כדי להרחיב את הידע על התפתחות מחלות וגילוי של סוכנים טיפוליים רומן8. בנוסף, שימוש בתאים הנגזרים ממטופל מאפשר למדענים להפיק מחדש הטרוגניות מוטציה כדי לחקור את הספקטרום של פנוטיפים המטופל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מטופל נגזר VM EC אשר מבטאים צורה מוטציה פעילה באופן זמני של TIE2 ו / או PIK3CA מוזרקים תת עורית בחלק האחורי של עכברים עירום אתימי. תאי כלי דם מוזרקים מושעים במסגרת ECM על מנת לקדם אנגיוגנזה כמתואר בדגמים xenograft כלידם קודמים 9,10,11. אלה VM EC לעבור מורפוגנזה משמעותית וליצור מוגדל, כלי פתולוגיים סוטה בהיעדר תאים תומכים. מודל xenograft המתואר של VM מספק פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קולינית של תרופות ממוקדות על יכולתם לעכב התרחבות בלתי מבוקרת של לומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל של VM. מודל murine זה מציג מערכת מצוינת המאפשרת לחוקרים להשיג הבנה עמוקה יותר של הגדלת לומן פתולוגית ויהיה אינסטרומנטלי בפיתוח טיפולים יעילים יותר ממוקדים לטיפול VM. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של חריגות כלי דם כגון מום ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לנורה לייקס על ההגהה. מחקרים שדווחו בכתב יד זה נתמכו על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, תחת פרס מספר R01 HL117952 (E.B.), חלק מהכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
