Ein vom Patienten abgeleitetes Xenograft-Modell für Venöse Fehlbildungen
Summary
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, um ein murines Xenograft-Modell der venösen Fehlbildung zu erzeugen. Dieses Modell basiert auf der subkutanen Injektion von vom Patienten abgeleiteten Endothelzellen, die hyperaktivierende TIE2- und/oder PIK3CA-Genmutationen enthalten. Xenograft-Läsionen rekapitulieren die histopathologischen Merkmale des VM-Patientengewebes.
Abstract
Venöse Fehlbildung (VM) ist eine vaskuläre Anomalie, die durch eine beeinträchtigte Entwicklung des venösen Netzwerks entsteht, was zu erweiterten und oft dysfunktionalen Venen führt. Der Zweck dieses Artikels ist es, sorgfältig die Etablierung eines murinen Xenograft-Modells zu beschreiben, das menschliche VM imitiert und in der Lage ist, die Heterogenität der Patienten widerzuspiegeln. Hyperaktivierende nicht vererbte (somatische) TEK (TIE2) und PIK3CA-Mutationen in Endothelzellen (EC) wurden als Haupttreiber der pathologischen Gefäßvergrößerung in DER VM identifiziert. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung, Reinigung und Erweiterung von patientenabgeleiteten EC-Exzessen mutierten TIE2 und/oder PIK3CA. Diese EC werden subkutan in den Rücken immundefizien athymischer Mäuse injiziert, um ektetische Gefäßkanäle zu erzeugen. Mit TIE2 oder PIK3CA-mutiertem EC erzeugte Läsionen werden innerhalb von 7-u20129 Tagen nach der Injektion sichtbar vaskularisiert und rekapitulieren histopathologische Merkmale des VM-Patientengewebes. Dieses VM-Xenograft-Modell bietet eine zuverlässige Plattform, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die VM-Bildung und -Erweiterung vorantreiben. Darüber hinaus wird dieses Modell für translationale Studien, die die Wirksamkeit neuartiger Wirkstoffkandidaten testen, bei der Verhinderung der abnormalen Gefäßvergrößerung bei menschlichen VMs von entscheidender Bedeutung sein.
Introduction
Defekte in der Entwicklung der Vaskulatur sind die zugrunde liegende Ursache für viele Krankheiten, einschließlich venöser Fehlbildung (VM). VM ist eine angeborene Krankheit, die durch abnormale Morphogenese und Ausdehnung derVenen1 gekennzeichnet ist. Wichtige Studien an VM-Gewebe und Endothelzellen (EC) haben Funktionsverstärkungsmutationen in zwei Genen identifiziert: TEK, das den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 kodiert, und PIK3CA, das die isoform p110(katalytische Subunit) der PI3-Kinase (PI3K)2,3,4,5kodiert. Diese somatischen Mutationen führen zu einer ligaandunabhängigen Hyperaktivierung wichtiger angiogener/wachstumssignaler Wege, einschließlich PI3K/AKT, was zu erweiterten ektatischen Venenführt 3. Trotz dieser wichtigen genetischen Entdeckungen sind die nachfolgenden zellulären und molekularen Mechanismen, die eine abnormale Angiogenese auslösen, und die Bildung vergrößerter Gefäßkanäle noch immer nicht vollständig verstanden.
Während der normalen und pathologischen Angiogenese sprießen neue Gefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz und EC durchlaufen eine Abfolge wichtiger zellulärer Prozesse, einschließlich Proliferation, Migration, extrazelluläre Matrix (ECM) Remodellierung und Lumenbildung6. Zwei- und dreidimensionale (2D/3D) In-vitro-Kulturen der EG sind wichtige Werkzeuge, um jede dieser zellulären Eigenschaften einzeln zu untersuchen. Dennoch besteht die klare Forderung nach einem Mausmodell, das die pathologische Gefäßvergrößerung innerhalb der Wirtsmikroumgebung rekapituliert und gleichzeitig eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für die translationale Forschung bietet.
Bis heute wurde kein transgenes murines VM-Modell im Zusammenhang mit TIE2-Funktionsverstärkungsmutationen berichtet. Aktuelle transgene VM-Mausmodelle basieren auf der allgegenwärtigen oder gewebebeschränkten Expression der aktivierenden Mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Diese transgenen Tiere geben signifikante Einblicke in die ganzkörper- oder gewebespezifischen Wirkungen dieser Hotspot-PIK3CA-Mutation. Die Einschränkung dieser Modelle ist die Bildung eines hochpathologischen Gefäßnetzes, das zu einer frühen Letalität führt. Daher spiegeln diese Mausmodelle das sporadische Auftreten von Mutationsereignissen und die lokalisierte Natur der VM-Pathologie nicht vollständig wider.
Im Gegenteil, patientenabgeleitete Xenograft-Modelle basieren auf der Transplantation oder Injektion von pathologischem Gewebe oder Zellen, die von Patienten in immundefizienten Mäusen abgeleitet wurden7. Xenograft-Modelle sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Wissen über die Krankheitsentwicklung und die Entdeckung neuer therapeutischer Wirkstoffe zu erweitern8. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Patienten-abgeleiteten Zellen Wissenschaftlern, die Heterogenität der Mutation zu rekapitulieren, um das Spektrum der Phänotypen von Patienten zu untersuchen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem patientenabgeleitete VM EC, die eine mutierte konstitutiv-aktive Form von TIE2 und/oder PIK3CA ausdrücken, subkutan in den Rücken athymischer Nacktmäuse injiziert werden. Injizierte Gefäßzellen werden in einem ECM-Rahmen suspendiert, um die Angiogenese zu fördern, wie in früheren vaskulären Xenograft-Modellen9,10,11beschrieben. Diese VM EC durchlaufen eine signifikante Morphogenese und erzeugen vergrößerte, durchfundierte pathologische Gefäße, wenn keine unterstützenden Zellen zur Unterstützung von Zellen zur Welt kommen. Das beschriebene Xenograft-Modell von VM bietet eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für ihre Fähigkeit, die unkontrollierte Lumenexpansion zu hemmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zum Generieren eines vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modells von VM. Dieses murine Modell stellt ein ausgezeichnetes System dar, das es Forschern ermöglicht, ein tieferes Verständnis der pathologischen Lumenvergrößerung zu gewinnen, und wird bei der Entwicklung wirksamerer und zielgerichteterer Therapien für die Behandlung von VM eine wichtige Rolle spielen. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Arten von vaskulären Anomalien wie kapillare lymphatische venöse Fehlbildu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Nora Lakes für das Korrekturlesen. Die in diesem Manuskript berichteten Forschungsergebnisse wurden vom National Heart, Lung, and Blood Institute unter der Award-Nummer R01 HL117952 (E.B.), einem Teil der National Institutes of Health, unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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