Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming
Summary
We presenteren een gedetailleerd protocol om een murine xenograft model van veneuze misvorming te genereren. Dit model is gebaseerd op de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide endotheelcellen die hyper-activerende TIE2 en/of PIK3CA genmutaties bevatten. Xenograftlaesies vatten de histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel nauwkeurig samen.
Abstract
Veneuze misvorming (VM) is een vasculaire anomalie die voortvloeit uit een verminderde ontwikkeling van het veneuze netwerk, wat resulteert in verwijde en vaak disfunctionele aderen. Het doel van dit artikel is om zorgvuldig te beschrijven de oprichting van een murine xenograft model dat menselijke VM nabootst en in staat is om patiënt heterogeniteit weerspiegelen. Hyperactiverende niet-erfelijke (somatische) TEK (TIE2) en PIK3CA mutaties in endotheelcellen (EC) zijn geïdentificeerd als de belangrijkste drijfveren van pathologische vaartuiguitbreiding in VM. Het volgende protocol beschrijft de isolatie, zuivering en uitbreiding van door de patiënt afgeleide EC die mutant TIE2 en/of PIK3CA uitdrukt. Deze EC worden onderhuids geïnjecteerd in de rug van immunodeficiënte athymische muizen om extatische vasculaire kanalen te genereren. Laesies gegenereerd met TIE2 of PIK3CA-mutant EC zijn zichtbaar gevasculariseerd binnen 7\u20129 dagen na injectie en recapituleren histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel. Dit VM xenograft model biedt een betrouwbaar platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die vm-vorming en -expansie stimuleren. Bovendien zal dit model een belangrijke rol spelen bij translationele studies die de werkzaamheid van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen testen om de abnormale uitbreiding van het vz..
Introduction
Gebreken in de ontwikkeling van de vasculatuur zijn de onderliggende oorzaak van vele ziekten, waaronder veneuze misvorming (VM). VM is een aangeboren ziekte die wordt gekenmerkt door abnormale morfogenese en uitbreiding van aderen1. Belangrijke studies over VM-weefsel en endotheelcellen (EC) hebben gain-of-function mutaties in twee genen geïdentificeerd: TEK, dat codeert de tyrosine kinase receptor TIE2, en PIK3CA, die codeert de p110α (katalytische subunit) isoform van PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Deze somatische mutaties resulteren in ligand-onafhankelijke hyper-activatie van belangrijke angiogene/groeisignaleringstrajecten, waaronder PI3K/AKT, wat resulteert in verwijde ectatische aderen3. Ondanks deze belangrijke genetische ontdekkingen zijn de daaropvolgende cellulaire en moleculaire mechanismen die abnormale angiogenese en de vorming van vergrote vasculaire kanalen veroorzaken nog steeds niet volledig begrepen.
Tijdens normale en pathologische angiogenese ontspruiten nieuwe vaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk en de EG ondergaan een opeenvolging van belangrijke cellulaire processen, waaronder proliferatie, migratie, extracellulaire matrix (ECM) remodellering en lumenvorming6. Twee- en driedimensionale (2D/3D) in vitro culturen van de EG zijn belangrijke instrumenten om elk van deze cellulaire eigenschappen individueel te onderzoeken. Niettemin is er een duidelijke vraag naar een muismodel dat de uitbreiding van pathologische vaartuigen binnen de micro-omgeving van de gastheer hervat terwijl het een efficiënt platform biedt voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor translationeel onderzoek.
Up-to-date is een transgene murinemodel van VM in verband met TIE2-functiemutaties niet gemeld. De huidige transgene VM-muismodellen zijn gebaseerd op de alomtegenwoordige of weefselbeperkte expressie van de activerende mutatie PIK3CA p.H1047R3,5. Deze transgene dieren geven significant inzicht in de effecten van deze hotspot PIK3CA mutatie. De beperking van deze modellen is de vorming van een zeer pathologisch vasculair netwerk dat resulteert in vroege dodelijkheid. Deze muismodellen weerspiegelen dus niet volledig het sporadische optreden van mutatiegebeurtenissen en gelokaliseerde aard van VM-pathologie.
Integendeel, door de patiënt afgeleide xenograftmodellen zijn gebaseerd op de transplantatie of injectie van pathologisch weefsel of cellen afkomstig van patiënten in immunodeficient muizen7. Xenograft-modellen zijn een krachtig hulpmiddel om de kennis over ziekteontwikkeling en ontdekking van nieuwe therapeutische middelen te verbreden8. Bovendien stelt het gebruik van patiënt-afgeleide cellen wetenschappers in staat om mutatieheterogeniteit samen te vatten om het spectrum van patiëntfenotypen te bestuderen.
Hier beschrijven we een protocol waarbij door de patiënt afgeleide VM EC die een gemuteerde constitutief-actieve vorm van TIE2 en/of PIK3CA uitdrukken, onderhuids worden geïnjecteerd in de rug van athymische naaktmuizen. Geïnjecteerde vasculaire cellen worden in een ECM-kader opgehangen om angiogenese te bevorderen zoals beschreven in eerdere vasculaire xenograftmodellen9,10,11. Deze VM EC ondergaan significante morfogenese en genereren vergrote, doorgesperde pathologische vaten bij afwezigheid van ondersteunende cellen. Het beschreven xenograftmodel van VM biedt een efficiënt platform voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor hun vermogen om ongecontroleerde lumenexpansie te remmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode om een door de patiënt afgeleid xenograft-model van VM te genereren. Dit murine model presenteert een uitstekend systeem dat onderzoekers in staat stelt om een dieper begrip van pathologische lumen uitbreiding te krijgen en zal instrumenteel zijn in de ontwikkeling van meer effectieve en gerichte therapieën voor de behandeling van VM. Dit kan gemakkelijk worden aangepast om andere soorten vasculaire afwijkingen te onderzoeken, zoals capillaire lymfefafe veneuze misvorming<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Nora Lakes bedanken voor het proeflezen. Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute, onder Award Number R01 HL117952 (E.B.), onderdeel van de National Institutes of Health. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
