نموذج Xenograft المستمدة من المريض للتشوه الوريدي
Summary
نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نموذج مورين xenograft من التشوه الوريدي. ويستند هذا النموذج على الحقن تحت الجلد من الخلايا البطانية المستمدة من المريض التي تحتوي على فرط تفعيل 12 و / أو الطفرات الجينية PIK3CA. Xenograft الآفات تُلخيّص عن كثب السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM.
Abstract
التشوه الوريدي (VM) هو شذوذ الأوعية الدموية التي تنشأ عن ضعف التنمية من الشبكة الوريدية مما أدى إلى الأوردة المتوسعة والمختلة وظيفيا في كثير من الأحيان. الغرض من هذه المقالة هو أن تصف بعناية إنشاء نموذج مورين xenograft الذي يحاكي VM الإنسان وقادرة على عكس عدم تجانس المريض. تم تحديد فرط تفعيل غير موروثة (الجسدية) TEK (TIE2) و PIK3CA الطفرات في الخلايا البطانية (EC) باعتبارها المحركات الرئيسية لتوسيع الأوعية المرضية في VM. يصف البروتوكول التالي عزل وتنقية وتوسع EC المستمدة من المريض التعبير عن متحولة TIE2 و / أو PIK3CA. يتم حقن هذه EC تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران الوثيميكية المناعية لتوليد قنوات الأوعية الدموية ectatic. الآفات المتولدة مع TIE2 أو PIK3CA-متحولة EC هي الأوعية الدموية بشكل واضح في غضون 7\u20129 أيام من الحقن وتكتل السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM. هذا النموذج Xenograft VM يوفر منصة موثوق بها للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تقود تشكيل الجهاز الظاهري والتوسع. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون هذا النموذج مفيدة للدراسات الترجمية اختبار فعالية المرشحين المخدرات رواية في منع التوسع السفينة غير طبيعية ينظر في VM الإنسان.
Introduction
العيوب في تطور الأوعية الدموية هي السبب الكامن وراء العديد من الأمراض بما في ذلك التشوهات الوريدية (VM). VM هو مرض خلقي يتميز بتشكل غير طبيعي وتوسع الأوردة1. وقد حددت الدراسات الهامة على أنسجة الجهاز الظاهري والخلايا البطانية (EC) اكتساب من الطفرات وظيفة في اثنين من الجينات: TEK، الذي يشفّر مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وPIK3CA، الذي يشفّر p110α (الوحدة الفرعية الحفازة) isoform PI3 كيناز (PI3K)2،3،4،5. هذه الطفرات الجسدية تؤدي إلى تنشيط فرط مستقل لليغانند من مسارات إشارة أوعية / النمو الرئيسية ، بما في ذلك PI3K / AKT ، مما أدى إلى الأوردة المتوسعة3. وعلى الرغم من هذه الاكتشافات الجينية الهامة، فإن الآليات الخلوية والجزيئية اللاحقة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية غير الطبيعية وتشكيل قنوات الأوعية الدموية الموسعة لا تزال غير مفهومة تماماً.
خلال تولد الأوعية الدموية الطبيعية والمرضية، تنبت أوعية جديدة من شبكة الأوعية الدموية الموجودة من قبل و EC تخضع سلسلة من العمليات الخلوية الهامة بما في ذلك الانتشار والهجرة وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشكيل التجويف6. ثنائي وثلاثي الأبعاد (2D/3D) في الثقافات في المختبر EC هي أدوات هامة للتحقيق في كل من هذه الخصائص الخلوية بشكل فردي. ومع ذلك، هناك طلب واضح لنموذج الماوس الذي يلخص تضخم الأوعية المرضية داخل البيئة الصغيرة المضيفة مع توفير منصة فعالة للتقييم قبل السريري للأدوية المستهدفة للبحوث الانتقالية.
وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن نموذج مورين معدل وراثياً لـ VM مرتبط بطفرات اكتساب الوظيفة من 11 إلى 100. تعتمد نماذج الماوس VM الحالية المعدلة على التعبير في كل مكان أو مقيد بالأنسجة من الطفرة النشطة PIK3CA p.H1047R3،5. هذه الحيوانات المعدلة وراثيا توفر رؤية كبيرة في الجسم كله أو الأنسجة آثار محددة من هذه النقطة الساخنة PIK3CA الطفرة. الحد من هذه النماذج هو تشكيل شبكة الأوعية الدموية المرضية للغاية مما أدى إلى الفتك المبكر. وبالتالي ، فإن هذه النماذج الماوس لا تعكس تماما حدوث متقطع من الأحداث الطفرة والطبيعة المترجمة من أمراض VM.
على العكس من ذلك ، تعتمد نماذج xenograft المستمدة من المريض على زرع أو حقن الأنسجة المرضية أو الخلايا المشتقة من المرضى إلى الفئران المناعية7. نماذج Xenograft هي أداة قوية لتوسيع المعرفة حول تطور المرض واكتشاف وكلاء علاجية جديدة8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخلايا المشتقة من المريض يسمح للعلماء بتكبيل التغايرية الطفرة لدراسة طيف الأنماط الظاهرية للمريض.
هنا، ونحن وصف بروتوكول حيث يتم حقن المرضى المستمدة VM EC التي تعبر عن شكل متحولة نشطة من TIE2 و /أو PIK3CA تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران عارية athymic. يتم تعليق الخلايا الوعائية عن طريق الحقن في إطار ECM من أجل تعزيز تولد الأوعية الدموية كما هو موضح في النماذج السابقة xenograft الأوعية الدموية9,10,11. تخضع هذه VM EC لتحولات morphogenesi كبيرة وتولد أوعية مرضية موسعة ومُلّقة في غياب الخلايا الداعمة. يوفر نموذج xenograft الموصوف لـ VM منصة فعالة للتقييم قبل الكلينيكي للأدوية المستهدفة لقدرتها على منع التوسع غير المنضبط في تجويف التجويف.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن وصف طريقة لتوليد نموذج xenograft المستمدة من المريض من VM. يقدم هذا النموذج مورين نظام ممتاز يسمح للباحثين بالحصول على فهم أعمق لتوسيع التجويف المرضي وسيكون له دور فعال في تطوير علاجات أكثر فعالية واستهدافًا لعلاج VM. هذا يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي مثل ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا بحيرات نورا على التدقيق اللغوي. وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم، تحت رقم الجائزة R01 HL117952 (E.B.)، وهي جزء من المعاهد الوطنية للصحة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
