Dette papir præsenterer fire af de mest almindelige teknikker til visualisering af BrdU-positive celler til måling af voksen neurogenese hos rotter. Dette arbejde omfatter instruktioner til reagensforberedelse, thymidinanalog administration, transkardieperfusion, vævspræparation, peroxidase immunohistokemisk reaktion, immunofluorescens, signalforstærkning, modfarvning, mikroskopibilleddannelse og celleanalyse.
En af de vigtigste ting inden for voksen hippocampus neurogenese (AHN) er identifikationen af de nyligt genererede celler. Immunodetektion af thymidinanaloger (såsom 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU)) er en standardteknik, der anvendes til visualisering af disse nygenererede celler. Derfor injiceres BrdU normalt i små dyr intraperitonealt, så thymidinanalogen bliver inkorporeret i delende celler under DNA-syntese. Detektion udføres ved immunohistokemisk analyse af hjerneskiver. Hver forskergruppe, der har brugt denne teknik, kan forstå, at det kræver særlig opmærksomhed på små detaljer for at opnå en vellykket plet. For eksempel er et vigtigt skridt DNA-denaturering med HCI, som gør det muligt at nå cellekernen for at plette den. De eksisterende videnskabelige rapporter beskriver imidlertid meget få af sådanne trin i detaljer. Derfor er standardisering af teknikken udfordrende for nye laboratorier, da det kan tage flere måneder at give positive og vellykkede resultater. Formålet med dette arbejde er at beskrive og uddybe trinene for at opnå positive og vellykkede resultater af immunfarvningsteknikken i detaljer, når man arbejder med thymidinanalogen BrdU. Protokollen inkluderer reagensforberedelse og opsætning, administration af thymidinanalog i en gnaver, transkardieperfusion, vævspræparation, peroxidase immunohistokemisk reaktion, anvendelse af avidin-biotinkompleks, immunofluorescens, modfarvning, mikroskopibilleddannelse og celleanalyse.
Ideen om, at nye neuroner genereres i den voksne menneskelige hjerne gennem hele levetiden, har fascineret det videnskabelige samfund i årtier. Den viden, at hjernen genererer nye neuroner gennem hele sin levetid, blev opnået gennem påvisning af celler under division 1,2. Påvisning af nygenererede neuroner i den voksne hjerne blev først identificeret ved intrakranielt injektion af tritieret thymidin (thymidin-H3) hos rotter og detektering af celler i cellecyklussen ved autoradiogrammer 1,2. Celledeling af glia og tilstedeværelsen af neuroblaster blev rapporteret, hvilket var de første lovende data om postnatal neurogenese1. Ikke desto mindre indebar brugen og påvisningen af thymidin-H3 brugen af radioaktivitet, hvilket kan være skadeligt for de mennesker, der styrer det. Den første indsats, der undersøgte egnetheden af BrdU-immunhistokemi i undersøgelsen af spredning, migration og oprindelse af celler i nervesystemet, optrådte i 1988 af Miller og Nowakowski3. I 1998 viste et papir udgivet af Eriksson og kolleger, at nye neuroner blev visualiseret postmortem i den menneskelige voksne hjerne hos patienter injiceret med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU)4. Disse patienter fik BrdU-injektionen (250 mg intravenøst) for at mærke væksten af tumorer4. Denne teknik blev vedtaget i dyremodeller. Indførelsen af disse metoder markerede en milepæl for feltet, da dette tillod detektion af nygenererede celler uden brug af radioaktive forbindelser. Denne procedure blev guldstandarden til måling af celleproliferation i voksne hjernenicher for at fremme yderligere forskning på området.
Begrænsningen af thymidinanalogteknikken er, at den ikke tillader bestemmelse af cellulær identitet for de nygenererede celler. Imidlertid giver immunohistokemi os mulighed for at udføre dobbelt- eller tredobbelt mærkningsteknik for den samme celle, som validerer de nygenererede cellers cellulære skæbne og endda deres modningsstadier, hvilket fører til yderligere udvikling af feltet. Denne metode blev karakteriseret til at differentiere nygenererede celler til glia, udifferentierede neuroner eller en fuldt moden granulær celle og endda for at bestemme, om de deltager aktivt i kredsløbet. Et andet gennembrud på området var brugen af transgene modeller til at identificere udifferentierede celler under nestins domæne. De transgene nestin-GFP-mus udtrykker et forbedret grønt fluorescerende protein (GFP), som er under kontrol af nestinpromotoren. Nestin er et mellemliggende filament kendetegnet ved stamceller5. Nestin-GFP transgene mus tillod at etablere tidlige udviklingstrin involveret i neurogenese6. En væsentlig begrænsning er dog at kunne opretholde en nestin-GFP transgen musekoloni under særlige forhold i et laboratorium, der bliver omkostningseffektivt for nogle videnskabelige grupper, især dem fra udviklingslande.
De ovennævnte teknikker har fordele og ulemper. Imidlertid repræsenterer identifikation af prolifererende celler ved immunhistokemi (IHC) og muligheden for at udføre dobbelt- eller tredobbelt mærkningsteknik ved immunofluorescens for at identificere cellemodningsstadium eller celleskæbne den mest gennemførlige måde at måle voksen neurogenese på, indtil videre. Identifikationsprocessen ved hjælp af immunhistokemi består af mærkning af proteiner, proteindomæne eller nukleotider med et specifikt antistof, der tillader deres genkendelse kendt som primært antistof. Sidstnævnte genkendes af det sekundære antistof, som er markeret med et kromogen (fx peberrodsperoxidase) eller en fluorochrom (fx FITC) kombineret med det sekundære antistof. Mikroskoper kan detektere både kromogener og fluorkromer signaler. Ved hjælp af IHC er det muligt at identificere membranproteiner, cytoskeletproteiner eller nukleare komponenter såsom BrdU. På den anden side kan BrdU findes i den cellulære kerne, da den inkorporeres i DNA’et under S-fasen ved konkurrence. Derfor er et afgørende skridt DNA-denaturering med HCI, som åbner DNA-bindinger for at give BrdU-antistoffet adgang til BrdU i DNA’et. Det er vigtigt at vide, at BrdU er til stede i en mættet koncentration hos mus og rotteserum i henholdsvis 15 og 60 minutter efter intraperitoneal administration og derefter falder hurtigt til uopdagelige niveauer ved henholdsvis 60 og 120 minutter7.
Her beskriver vi fire forskellige, men nært beslægtede IHC-teknikker: kromogen indirekte detektion ved hjælp af peberrodsperoxidase (HRP) reaktion med DAB (3,3′-diaminobenzidin) sans signalamplifikation (trin 4.1), avidin-biotinkompleks (ABC) amplifikation (trin 4.1), indirekte immunofluorescensdetektion uden signalforstærkning (trin 4.4) og mærket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikation (trin 4.3). Hver metode har fordele og ulemper og kan være nyttig til specifikke vævsbehov (se tabel 1). Vi besluttede at følge indirekte ICH-metoder på grund af deres overkommelige pris og enkelhed til at foretage ændringer fra kromogene til fluorescerende detektionsmetoder, når vi bruger ukonjugerede primære antistoffer. HRP-tilgangen er en almindeligt anvendt IHC-metode på grund af dens overkommelige pris, høje stabilitet, høje omsætningshastighed og substraters fulde tilgængelighed. Ikke desto mindre anbefaler vi at bruge en positiv kontrol til at bekræfte, at farvningsmetoden fungerer nøjagtigt, og brugen af negativ kontrol til at teste antistoffunktionen effektivt. Flere immunfarvninger eller multiplex IHC-metoder (se trin 6) er potente værktøjer til at erhverve store mængder data fra vævssektionen i et enkelt eksperiment. Denne teknik er særlig vigtig, når tilgængeligheden af prøver er begrænset. En anden fordel er muligheden for samtidig at identificere specifikke proteiner, der co-udtrykkes i det samme cellulære rum, samtidig med at vævsintegriteten bevares. Multiplex gør det muligt at plette forskellige markører udtrykt under specifikke proliferative stadier (f.eks. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), hvilket gør det muligt for os at nå en mere detaljeret sprednings- og differentieringsforskning8. Det er afgørende at vælge antistoffer, der er kompatible med den fikseringsteknik, der bruges til at undgå krydsreaktivitet. Vi anbefaler at teste hvert nyt antistof (inklusive BrdU) individuelt for at justere og forfine metoden. Indfør derefter den dobbelte sekventielle farvning, og start til sidst den samtidige immunfarvningsproces, når den sekventielle metode domineres fuldstændigt. Det er afgørende at vælge passende sekundære antistoffer til denne metode.
Metode | Specifik metode | Fordele | Ulemper |
Indirekte detektionsmetode | Peroxidasereaktion med DAB | 1. Højere følsomhed end metoden med direkte detektion og indirekte fluorescens. 2. Højere modstandsdygtighed over for fotoblegning end fluorkromer. 3. Lavere omkostninger end fluorescensdetektionsmetode |
1. Vanskeligt for Multiplexing med færre farvefarvestoffer. 2. Kompliceret for Co-udtrykte mål i samme cellulære rum. 3. Reduceret dynamisk område for samtidige knappe og høje rigelige mål på det samme væv. |
Fluorescens | 1. Bedst og nemmest til Multiplexing med flere farvefarvestoffer. 2. Bedst til Co-udtrykte mål i det samme cellulære rum. 3. Bedre dynamisk område for samtidige knappe og høje rigelige mål på det samme væv. 4. Ingen yderligere trin. |
1. Lavere følsomhed end den indirekte peroxidasereaktion med DAB-metoden. 2. Svag modstand mod fotoblegning over tid. 3. Dyrere. |
|
Signalforstærkningsmetode | Avidin-Biotin-kompleks (ABC) | 1. Højere følsomhed end den direkte og indirekte detektionsmetode. 2. Reducer baggrunden |
1. Yderligere trin. 2. Dyrere end ikke forstærkning. |
Mærket streptavidin-biotin (LSAB) | 1. Højere følsomhed end den direkte og indirekte detektionsmetode. 2. Mere omfattende vævspenetration end ABC-metoden. 3. Reducer baggrunden |
1. Yderligere trin. 2. Dyrere end ABC-metoden. |
|
Ikke yderligere forstærkningsmetode | 1. Lavere omkostninger. 2. Ingen yderligere trin. 3. Ideel til høje rigelige mål. |
1. Lavere følsomhed: problematisk uden rigelige mål. |
Tabel 1: Fordele/ulemper ved IHC-teknikker. Denne tabel viser fordele/ulemper ved indirekte detektionsmetoder: peroxidasereaktion med (3,3′-diaminobenzidin) DAB og fluorescens; og signalforstærkningsmetoder: avidin-biotinkompleks (ABC), mærket streptavidin-biotin (LSAB) og ikke yderligere amplifikationsmetode.
Et billede i høj opløsning er grundlæggende for at udføre korrekt analyse og præsentere resultaterne. Der er to tilgange til at forbedre opløsningen: 1) brug af et bedre mikroskopdesign (f.eks. Konfokal, multifoton) eller 2) numerisk invertering af sløringsprocessen for at forbedre billeder ved hjælp af dekonvolution9. Desværre er konfokalmikroskopi ikke overkommelig på grund af de høje omkostninger ved udstyr og dets service10. Et vidvinkelepifluorescensmikroskop og den efterfølgende dekonvolution af z-stack-billederne giver et passende, billigt alternativ til konfokalmikroskopi 8,9. Som nævnt ovenfor er dekonvolutionsmålet at gendanne det originale signal, der blev nedbrudt af erhvervelsessystemet9, ved at reducere sløring, uklar tåge og forvrængning vist på billedet opnået ved hjælp af et epifluorescens eller konfokalmikroskop ved hjælp af matematiske fjernelsesalgoritmer10. Det erhvervede slørede billede kan matematisk modelleres som et resultat af at vikle de observerede objekter med en 3D-punktspredningsfunktion (PSF). PSF er et teoretisk diffraktionsmønster af de lyspunkter, der udsendes af vævsprøven og opsamles af mikroskopet. PSF-fil oprettes med de specifikke betingelser for hvert billede, såsom kameraets CCD-celleafstand, brydningsindeks for det anvendte medie, objektivobjektivets numeriske blænde, fluoroforens emissionsbølgelængde, billedstørrelser, antal billeder i z-stack-behandlingsmetoden og mellemrummet mellem dem (se teknisk specifikation i tabel 2). Med andre ord opsummerer PSF-filen virkningerne af billeddannelsesopsætningen på mikroskopobservationerne9. Vi bruger dog diffraktions PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) til at oprette vores egen specifikke PSF-fil til hvert z-stack-billede. Z-stack-billeder er en række digitaliserede optiske sektioner fra definerede dybder (z-akse) på samme XY-placering som diaset. En computer kompilerer de oplysninger, der opnås fra fokusplanet, ved at omfordele signaler, der stammer fra objekter placeret i andre brændplaner. For at oprette z-stack-billeder er det nødvendigt at tage billeder fra forskellige fokuserede lag af diasene (f.eks. ti forskellige billeder af det samme XY-område hver 1 μm dybde). Derefter bruger vi mikroskopisoftware leveret af producenten eller Fiji til at oprette et z-stack eller 3D-billede. Resultatet bliver en enkelt stakbilledfil (f.eks. ti billeder med forskellige fokus). Der er flere kundespecifikke værktøjer og softwareløsninger, såsom open source-software til dekonvolutionsmikroskopi. Vi viser outputtene fra dekonvolutionsprocessen ved hjælp af DeconvolutionLab29, som er et Fiji11-plugin (distribution af ImageJ12). Dekonvolution vil bidrage til at forbedre opløsningen af endelige mikrografier (se figur 1B, C ). For yderligere information og instruktion anbefaler vi kraftigt at læse reference13.
Figur 1: Repræsentativt billede af 3D-dekonvolution for flere farvekanaler. (A) GD med lav forstørrelse. (B) De originale z-stack-billeder for hver kanal og det flettede billede. (C) 3D-deconvoluted z-stack-billeder for hver kanal og det flettede billede. Denne hjerne var fra rotten, der var en del af fysisk aktivitetsgruppe. Mærket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikationsmetode blev anvendt. Det viste Cy3 streptavidin konjugeret antistof til angivelse af BrdU (rød), DAPI som modfarvning (blå) og glial fibrillær sur protein (GFAP) som en astroglial markør (grøn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær zone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Formålet med dette arbejde er at give en detaljeret beskrivelse af trinene til at opnå positive og vellykkede resultater med immunfarvning og at liste almindeligt anvendte trin i BrdU-baserede studier uden brug af et konfokalmikroskop. BrdU-farvning er en teknik, der kræver flere trin, der skal følges nøje for at opnå en vellykket plet. Standardisering af disse farvningsteknikker tager typisk måneder og er tids- og ressourcekrævende. Vi forventede, at denne artikel kunne give oplysninger til de grupper, der starter inden for dette område, ved at reducere tid og fejl.
Voksen neurogenese er en proces, der forekommer hyppigst i nicher af voksne neurale forløberceller, der har potentiale til at generere nye neuroner gennem hele deres levetid. Bromodeoxyuridin (BrdU) mærkning er meget udbredt i immunologi til at karakterisere antallet af nygenererede celler i en voksen hjerne. BrdU vil hovedsageligt blive inkorporeret i celler i diskrete hjerneområder (neurogene zoner). Disse celler er placeret i den subventrikulære zone (SVZ), dentate gyrus i hippocampus – mellem hilus og granulære celler kendt som sub-granulær zone (SGZ) 1,2,18. Desuden er der forskellige hjerneområder præget af en lavere proliferativ kapacitet i voksenalderen, herunder hypothalamus, striatum, neocortex og amygdala19. Som tidligere nævnt er BrdU-farvning den almindeligt anvendte metode til forskning i neurogenese hos voksne til at detektere celleproliferation. Brugen af BrdU som markør har dog begrænsninger og faldgruber. Den første er, at BrdU er en cellecyklusmarkør. Derfor skal dobbelt eller tredobbelt farvning udføres for at identificere celleskæbnen og inkludere cellemarkører for at detektere det specifikke udviklingsstadium af de celler, der er mærket. En yderligere bekymring om BrdU er, at det er en giftig og mutagen opløsning, der ændrer DNA-stabilitet, kan ændre cellulær funktion og cellecyklusser. Der bør tages hensyn til de tidligere oplysninger, når det besluttes at følge en administrationsprotokol og administrationsdoser (50-600 mg/kg). Et andet afgørende træk er, at BrdU er en DNA-syntesemarkør, ikke en celleproliferationsmarkør14. Derfor er det relevant at skelne celleproliferation fra andre begivenheder såsom en DNA-reparation, abortiv cellecyklus genindtræden og genduplikering. Forskerne skal følge passende kontroller for at sikre korrekt anvendelse af BrdU. For en mere detaljeret diskussion om disse problemer og begrænsninger anbefaler vi at gennemgå Taupins arbejde14. Standardiseringsprocessen for en immunhistokemisk protokol kan være langsom og udfordrende. I dette arbejde har vi præsenteret alle de generelle trin til at styre en vellykket IHC-protokol. Vi anbefaler dog, at hver forskningsgruppe tester og evaluerer væv, antistoffer og tilstande på forhånd. Test og evalueringer skal udføres med mindst tre forskellige niveauer af inkubationer, vasketrin og styrker for hvert antistof og væv, der testes. Vi anbefaler også, at forskere gennemgår yderligere protokoller for at kunne vælge den bedste, der opfylder specifikke behov og krav 20,21,22,23,24,25.
Som tidligere nævnt involverer proceduren flere trin og metodiske overvejelser, der almindeligvis anvendes og nævnes i videnskabelige artikler, som senere vil blive diskuteret. Vi anbefaler, at forskerne vælger antistofferne omhyggeligt og korrekt med hensyn til teknik, budget, udstyr, opsætning og hovedforskningsmål. Antistoffer skal testes med samme type væv, som senere testes i forsøget. Vi anbefaler også brugen af et antistof, der blev testet til samme formål (IHC) (dvs. ikke kun i western blot eller flowcytometriteknikker) for at teste dets kompatibilitet med fikseringsteknikken. Forskellige veje kan anvendes til administration af BrdU-farvningen, såsom intraperitoneal injektion, intraperitoneal infusion, oral indtagelse eller intraventrikulær infusion (for en mere detaljeret beskrivelse af hver teknik, se reference26). Hvis den intraperitoneale injektion vælges, skal du sørge for, at BrdU administreres i bughulen og undgå tarmområdet. Da tarmen har flere celler i duplikering, der kan udtømme BrdU, før den kommer til hjernen, hvilket vil påvirke antallet af mærkede celler. Det er afgørende at få tynde sektioner, da de tillader en bedre penetration af løsninger. Koronale skiver på 40 μm tykke blev skåret rostro-kausalt og blev overført til en 24-brønds cellekulturplade efter den stereologiske procedure foreslået af Kempermann et al.27. Immunhistokemien kan udføres med væv monteret på dias eller som fritflydende sektioner. Da BrdU er placeret dybt i cellekerner, tillader det indtrængning af løsninger i fritflydende sektioner, hvilket giver bedre resultater og bedre adgang til interesseområdet. Det er vigtigt at åbne DNA-bindinger (DNA-denaturering) for at give adgang til det primære anti-BrdU-antistof. I dette arbejde udførte vi disse specifikke procedurer med brug af HCI-inkubation. På den anden side tillod processen med at blokere uspecifikke epitoper en mere præcis identifikation af cellesignal.
Den gode membranpermeabilisering gør det muligt for antistofferne at trænge korrekt ind i interesseområdet. Tilføjelse af en permeabilizer som Triton X-100 til PBS ++ og PBS + opløsninger forbedrer membranpermeabilisering. Både PBS og Tris-bufret saltvand (TBS) reagenser kan anvendes i denne protokol. Med hensyn til budget kunne TBS være relativitet billigere end PBS. PBS kan imidlertid interferere med antiphosphatantistoffer og hæmme alkaliske fosfatasekonjugerede antistoffer, så undgå brug af PBS, hvis målet er posttranslationelt modificeret ved phosphorylering (dvs. phosphoryleret). Vi brugte PBS til dette arbejde, og vi fandt ud af, at vævsvasketrin gav et mere specifikt signal. Vi anbefaler også forskere at udføre mindst tre vaskecyklusser ved hjælp af enten TBS o PBS. Opløsningerne skal være frisklavede. Antigenudtagning (AR) er en metode, der har til formål at reducere tabet af antigenicitet forårsaget af fikseringen, som ændrer strukturen af tertiære og kvaternære antigener. Denne reduktion gør antigener uopdagelige af antistoffer28,29. Den varmeinducerede epitophentning (HIER), der anvendes i denne protokol, forsøgte at vende de kemiske reaktioner mellem formaldehyd og proteiner ved høj temperatur eller stærk alkalisk hydrolyse (med andre bufferopløsninger som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det er vigtigt at teste nye antistoffer med forskellige AR-protokoller for at sammenligne resultater og vælge den bedste til protokollen. Dette sidste trin kan være valgfrit i en almindelig protokol; Vi behandlede dog væv med en antigenhentningsprotokol for at give bedre resultater for denne protokol.
Det er afgørende at vælge den korrekte endelige kontrastfarve og modfarvningsteknikken under hensyntagen til den primære farvningsfarve og metode, der bruges til at gøre en ikke-farvningsstruktur synlig og undgå at maskere den primære farvningsfarve fra immunreaktionen. Til fluorescensmikroskopi er DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindol) en meget populær nuklear og kromosom-modplet, der udsender blå fluorescens (absorption: 360 nm, emission: 460 nm) ved binding til AT-regioner af DNA. DAPI-holdigt monteringsmedium er tilgængeligt og er let at bruge; Dette giver fremragende signalbevarelse til billedoptagelse. Til peroxidreaktionen var IHC tilgængelig i forskellige muligheder, såsom cresylviolet, hæmatoxylin, neutral rød eller methylgrøn farvning. For flere immunfarvningsteknikker er det afgørende at vælge et kompatibelt antistof med fikseringsteknikken, der bruges til at undgå krydsreaktivitet30. Når problemer og komplikationer med enkeltfarvning er løst, skal du administrere en anden farvefarvning efter behov. Det er afgørende at kontrollere den ikke-specifikke binding mellem de sekundære antistoffer. Dette kan gøres ved at mætte de primære antistoffer, før der anvendes et sekundært antistof produceret i samme værtsart af de primære antistoffer. For eksempel, når der anvendes anti-mus produceret i kanin og anti-kanin produceret i geder sekundære antistoffer, skal anti-kaninen produceret i gedeantistof anvendes før anti-mus produceret i kaninantistof. Når den sekventielle metode domineres fuldstændigt, kan den samtidige immunfarvningsproces initieres. I denne metode er det vigtigt at vælge sekundære antistoffer korrekt. Ideelt set skal alle disse antistoffer komme fra det samme værtsdyr for at undgå krydsreaktivitet. Vi anbefaler at køre en positiv kontrol for at bekræfte, at farvningsmetoden fungerer nøjagtigt i postnatal hippocampusvæv (rigelig neurogenese omkring denne alder). Hvis det positive kontrolvæv viser farvningsproblemer, skal du gennemgå og gennemgå proceduren, foretage korrektioner og justeringer og gentage, indtil der produceres en god farvning. Kør derefter en negativ kontrol for at teste, at antistoffet virker korrekt ved at udelade eller erstatte et bestemt primært antistof med normalt serum (samme art som det primære antistof). Som nævnt i indledningen er billeddekonvolution et kraftfuldt værktøj og giver et alternativ, når et konfokalmikroskop ikke er tilgængeligt. Det kan anvende billeddekonvolutionen på alle billeder, der er opnået ved hjælp af transmitteret lysfelt, vidvinkelfluorescens og konfokal fluorescensmikroskopi. Det ultimative formål med billeddekonvolution er at rekonstruere det oprindelige signal om, at erhvervelsessystemet forringes10.
Sammenfattende er identifikationen af de nyligt genererede celler visualiseret ved immunodetektion af thymidinanalog BrdU en kompliceret, men kraftfuld teknik. Dette arbejde er et forsøg på at hjælpe forskere, især inden for voksen hippocampal neurogenese, til at kvantificere nye celler mere præcist. Vi håber, at denne indsats har været nyttig for det videnskabelige samfund og gør det lettere at finjustere undersøgelsen af celleproliferation ved hjælp af immunhistokemiteknikken.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Miguel Burgos og Gustavo Lago for at yde teknisk bistand. Vi vil også gerne takke Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez og Dr. Oscar Galicia for deres venlige støtte til at levere reagenser og materiale. Vi takker også División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for at yde finansiering til udførelsen af dette arbejde og for at dække videoproduktionsudgifter.
REAGENT PREPARATION AND SETUP | |||
Donor Horse Serum | BioWest | S0900 | Blocking and incubation solutions in PBS |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | toxic, flammable |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 746436-500G | |
Potassium Phosphate, monobasic | J.T Bker | 3246-01 | |
Sacarose | J.T Baker | 4072-01 | |
Sodium Chloride | Meyer | 2365-500G | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Corrisive, to calibrate pH |
Sodium Phophate Dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-5KG | |
Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION | |||
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
23–27G hypodermic needle | BD PrecisionGlide | ||
Saline solution | PiSA | 30130032 | |
Syringes 1 mL | NIPRO | ||
TISSUE PREPARATION | |||
15-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
50-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339652 | |
Dissecting tools | |||
Guillotine | Stoelting | ||
Microtome Cryostat | MICROM | HM525 | |
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | 7553-70 | |
Shaker | IKA | ROKCER 3D Digital | |
IMMUNOSTAINING | |||
Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | 1%, Light sensitive |
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | carcinogenic, light sensitive |
Hydochloric Acid | J.T.Baker | 9535-05 | Corrosive, to calibrate pH |
Hydrogen Peroxide, 50% | Meyer | 5375-1L | Toxic, oxidative |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Light sensitive |
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | PK-6100 | enzymatic, avidin/biotin based amplification system |
Primary antibodies | |||
Anti-GFAP antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | HPA056030 | 1:500 |
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse | Sigma-Aldrich | B2531 | 1:250 |
Secondary antibodies | |||
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-065-151 | 1:250 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | G-21040 | 1:1000 |
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC | Sigma-Aldrich | T5393 | 1:250 |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC | Invitrogen | F-2765 | 1:250 |
Streptavidin, Cy3 | Vector Laboratories | SA-1300 | 1:250 |
IMAGING AND ANALYSIS | |||
Computer | Dell Computer Company | T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB | For controlling and monitoring protocols’ processes |
CCD-camera | Olympus | UC50 | |
CellSens Standard software | Olympus | cellSens Standard Edition | Acquisition Software |
Epifluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
High-pressure 130 W mercury arc lamp | Olympus | U-HGLGPS | |
low autofluorescence immersion oil | Olympus | MOIL-30 Type F | |
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24 60 mm) | |||
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76 26 mm) | |||
U-FBW filter cube | Olympus | U-FBW | excitation 460 – 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm |
U-FGW filter cube | Olympus | U-FGW | excitation 530 – 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm |
U-FUW filter cube | Olympus | U-FUW | excitation 340 – 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm |