Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

Das Recycling von Wasser in landwirtschaftlichen Betrieben und Baumschulen wird aufgrund der steigenden Wasserkosten und der Umweltbedenken hinter der Wassernutzung immer beliebter. Viele Bewässerungsmethoden wurden für Züchter entwickelt, um die Ausbreitung und das Auftreten von Pflanzenkrankheiten zu reduzieren. Unabhängig von der Quelle des Wassers (Bewässerung oder Niederschlag) wird Abflusses erzeugt, und viele Gemüse- und Gärtnereien haben einen Teich, um Abflusses zu sammeln und zu recyceln¹. Dadurch entsteht ein Reservoir für eine mögliche Anhäufung von Krankheitserregern, die die Ausbreitung von Krankheitserregern begünstigt, wenn das recycelte Wasser zur Bewässerung von Pflanzen^2,3,4verwendet wird. Oomycete Pflanzenpathogene profitieren besonders von dieser Praxis, da Zoosporen sich im Wasser ansammeln und die primäre dispersive Sporen ist selbst-motil, erfordert aber Oberflächenwasser^5,6,7. Phytophthora capsici ist ein Oomycete-Erreger, der eine erhebliche Anzahl von solanaceous und Cucurbit Kulturen in verschiedenen^Weisen8 betrifft. Oft sind die Symptome Dämpfung von Sämlingen, Wurzel und Krone Fäulnis; Bei Kulturen wie Gurke, Kürbis, Melone, Kürbis, Wassermelone, Auberginen und Pfeffer können jedoch ganze Ernten durch Fruchtfäule verloren gehen⁹. Obwohl es bekannte Methoden zum Nachweis dieses Pflanzenerregers gibt, benötigen die meisten eine Infektion, die bereits stattgefunden hat, was zu spät ist, damit irgendwelche präventiven Fungizide eine signifikante Wirkung haben¹⁰.

Die traditionelle Methode, Bewässerungswasser für den Nachweis und die Diagnose von gezielten Mikroorganismen zu testen, ist ein antiquierter Ansatz, wenn Geschwindigkeit und Empfindlichkeit entscheidend für den Erfolg und profitable Pflanzenproduktion sind^11,12. Pflanzengewebe, das für den gezielten Erreger empfänglich ist (z. B. Auberginen für P. capsici), wird an einer modifizierten Falle befestigt, die über einen längeren Zeitraum in einem Bewässerungsteich aufgehängt wird, bevor sie entfernt und auf Infektionen untersucht wird. Proben aus dem Pflanzengewebe werden dann auf semiselektiven Medien (PARPH) plattiert und für das Kulturwachstum inkubiert, dann wird die morphologische Identifizierung mit einem zusammengesetzten Mikroskop¹³durchgeführt. Es gibt andere ähnliche Nachweismethoden für andere Pflanzenpathogene, die selektive Medien verwenden und kleine Mengen kontaminierten Wassers plattieren, bevor^{sie 14,15}sub-culturing sub-culturing. Diese Methoden erfordern zwischen 2 und 6 Wochen, mehrere Unterkultivierungsrunden, um den Organismus zu isolieren, und Erfahrung mit Phytophthora-Diagnostik, um die wichtigsten morphologischen Charaktere jeder Art erkennen zu können. Diese traditionellen Methoden eignen sich nicht gut für den Nachweis von Bewässerungswasser, das durch P. capsici aufgrund von Faktoren wie Interferenzen durch andere Mikroorganismen kontaminiert ist, die auch in den Wasserquellen vorhanden sind. Einige schnell wachsende Mikroorganismen wie Pythium spp. und wassergetragene Bakterien können auf der Platte überwuchern, so dass P. capsici nicht nachweisbar^16,17.

Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer empfindlichen und spezifischen molekularen Methode, die sowohl in Feld- als auch laboratoriumsspezifischen Umgebungen zum Nachweis von P. capsici Zoosporen im Bewässerungswasser verwendet werden kann. Das Protokoll beinhaltet die Entwicklung eines neuartigen schleifenvermittelten isothermen Amplifikations-Primers (LAMP)-Primers, das in der Lage ist, P. capsicispezifisch zu verstärken, basierend auf einem 1121-Basenpaar (bp) Fragment von P. capsici^18,19. Ein zuvor entwickelter LAMP Primer von Dong et al. (2015) wurde im Vergleich zu dem für diese Studie entwickelten Test verwendet²⁰.

Der LAMP-Assay ist eine relativ neue Form der molekularen Detektion, die nachweislich schneller, empfindlicher und spezifischer ist als herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR)²¹. Im Allgemeinen können herkömmliche PCR-Assays nicht unter 500 Kopien (1,25 pg/l) erkennen; Im Gegensatz dazu haben frühere Studien gezeigt, dass die Empfindlichkeit von LAMP 10 bis 1.000 Mal höher sein kann als herkömmliche PCR und leicht sogar 1 fg/l genomische DNA^22,23erkennen kann. Darüber hinaus kann der Test schnell (oft in 30 min) und vor Ort (im Feld) mit einem tragbaren Heizblock für die Verstärkung und einem kolorimetrischen Farbstoff durchgeführt werden, der die Farbe für eine positive Probe ändert (wodurch die Elektrophorese entfällt). In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit von PCR- und LAMP-Assays mit einer Filterextraktionsmethode verglichen. Die vorgeschlagene Nachweismethode ermöglicht es Forschern und Erweiterungsmitteln, das Vorhandensein von P. Capsici-Sporen aus verschiedenen Wasserquellen in weniger als zwei Stunden leicht zu erkennen. Der Test ist nachweislich empfindlicher als herkömmliche PCR und wurde vor Ort durch den Nachweis des Vorhandenseins des Erregers in dem von einem Züchter verwendeten Bewässerungswasser validiert. Diese Nachweismethode wird es den Züchtern ermöglichen, das Vorhandensein und die Populationsdichte des Erregers in verschiedenen Wasserquellen zu schätzen, die für die Bewässerung verwendet werden, wodurch verheerende Ausbrüche und wirtschaftliche Verluste verhindert werden.