Na⁺/K⁺ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索

注:無脊椎動物実験対象は、NIHまたはエモリーおよびジョージア州立大学によって規制されていません。それにもかかわらず、この研究で使用されるリーチの苦しみを最小限に抑えるためにすべての措置が講じられました。 1. リーチ神経コードから孤立した神経節7を準備する 12:12の明暗サイクルで16°Cで脱イオン水で希釈した人工池水(海塩の0.05%を含む)でヒル ド・ヴェルバナ を脱液に維持します。 砕いた氷のベッドで冷たい麻酔をして、動かくなるまで10分間>して解剖のためにリーチを準備します。 黒の樹脂張りの解剖皿を、115 mM NaCl、4 mM KCl、1.7 mM CaCl 2、10 mM D-グルコース、および10 mM HEPESを含む冷たい生理食類で〜1cmの深さまで、脱イオン水で充填します。pHは1 M NaOHで7.4に調整した。リーチの裏側を黒い樹脂裏打ち室にピン留めします(少なくとも2cmの厚さの樹脂の上に少なくとも2cmの深さで、少なくとも20cm x 10cm)。 斜めの導光灯照明で20倍の倍率でステロ顕微鏡の下で、身体の1/3番目 の部分の胴壁を通して5mmのスプリングハサミで長さ3cm以上の長手切りを行います。ピンを使用して体壁を脇に引っ張り、内臓を露出させます。注:保存された血液の食事は、火で磨かれたパスツールピペットで吸引することによって除去することができます。 個々の中型神経節7(脳に7番目の自由な分節性神経節尾体)を分離する。 5mmスプリングハサミを使用して、神経コードが存在する大台を開きます。正気で正気を切り裂き、腹腔を2本の部分に残してください。切断を導き、しなじを保持するために鋭い#5鉗子を使用してください。 神経節から出てくる2つの両側神経根のそれぞれに根本の根根を取り付けて(各根にしっかりと付着する)、これらの根本の部分を使用して神経節を固定する。 神経節(可能な限り7番目 の神経節から離れた)と鼻のストリップを結ぶ羅門と尾骨結合神経束を切断することによって、体から神経節を取り除き、根を横に切って、根を鼻から出てくる場所に切ります。 短いミニットン昆虫ピン、腹側、透明な樹脂が並ぶペトリ皿で、ガングリオン(古い鈍い#5鉗子を使用して)をピン留めします。根と、できるだけ神経節から離れた、根と鼻孔および尾子結合に付着する緩い組織のストリップにピンを挿入します。注:録音中に下からの良好な照明を達成する場合は、樹脂は3mm以上の厚さにする必要があります。ガングリオンが縦方向にも横方向にも緊張していることを確認してください 立体顕微鏡の倍率を40倍以上に増やし、神経細胞体が会縁部のすぐ下の神経節の腹側表面に容易に見られるように斜めの照明を調整する。 マイクロシザーでガングリオン(デシース)のペリネリウムを取り除きます。 片側の根の間の緩い鞘を切断して脱皮を開始し、反対側に横方向にカットを続け、はさみ刃を表面的に保ち、鞘の真下の神経細胞体に害を与えないようにします。 正線に沿って横切りから同様の表面的なカットを行います。 今、細かい#5鉗子で片側の鞘のコードラテラフラップをつかみ、ガングリオンから引き離し、マイクロシザーでそれを遮断します。 反対側で繰り返します。この手順は、マイクロ電極で記録するための両方のHN(7)ニューロンを公開します。 録音セットアップに準備皿を置き、室温で5mL/分の流量で生理食物でスーパーフューズします。 2. 鋭利な微小電極を用いたリーチ心拍間を識別し記録する HN(7)ニューロンの記録(記録は30〜60分の間)の間、デジタルデータ取得(アナログからデジタル、AからD)および刺激(アナログ、DからA)システムを用いて5kHzの速度で、神経生理学的電気計のサンプリングから細胞内電流および電圧トレースを取得し、デジタル化し、 をクリックして、コンピュータの画面に表示します。注: 商用またはカスタム構築のソフトウェア、および A から D から A へのボードは、データの取得 (A ~ D) に使用できます。D から A へのソフトウェアとカスタム構築ソフトウェアは、動的クランプに必要です。 下から暗視野照明を備えた50-100xのステロ顕微鏡の下で、中間神経節7の後方位置にある正準位置によって、両側対のHN(7)ニューロンを暫定的に同定する。 今度は、2 M酢酸カリウムと20 mM KClをマイクロマニピュレータを使用して満たされた鋭い微小電極を持つ推定HN(7)ニューロンを貫通することを目指します。 マイクロ電極をターゲットセル本体の近くに置きます。 電計で記録電位を継続的に観察し、ニューロンを貫通する前にこの電位をゼロmVに設定します。 マイクロ電極でニューロンを貫通し、マニピュレータで長軸に沿って電極をゆっくりと駆動する。電解波機能を使用して、膜電位の負のシフトと活発なスパイク活性が観察されるまで、100 msのバズ持続時間に設定する。 3kHz ≥の不連続電流クランプモード(DCC)に電計を設定して膜電位を同時に記録し、単一のマイクロ電極で電流を通過します(容量補償はリングのすぐ下に設定され、10%ダイヤルバックされます)。 オシロスコープ上のDCC中の電極の沈降を監視します。 1~2分間、電気計安定電流インジェクターで-0.1 nAの安定電流を注入し、記録を安定させます。 特徴的なスパイク形状と弱い破裂活性によってHN(7)ニューロンを明確に特定する(図1Ci)。 実験が完了した後、データ分析をオフラインで実行し、すべてのデータをディスクに保存します。 3. リアルタイムのHNまたは他のモデルニューロンを構築する デジタル信号処理ボード(DSB)を使用してカスタムソフトウェアを構築します。D to AおよびA to D)は、他のニューロンまたは実験のために2、4または異なるモデル電流に記載されているモデル電流をリアルタイムで実装するデスクトップコンピュータで。 モデル電流を表現する一般的に好ましい方法として、ホジキン-ハクスリースタイル方程式を使用します。 ポンプ電流を追加する前のリアルタイムHNモデルとダイナミッククランプの実装の詳細については、7 を参照してください。HNモデルにおける生きているHN(7)ニューロンの電流、細胞内Na+ 濃度、および伝導度の説明については、導入セクションを参照してください。 4. ダイナミッククランプのコンダクタンス/電流を実装し、変化 DSB 用のカスタムメイドのダイナミック クランプ ソフトウェアを使用して、グラフィカル ユーザ インターフェイス (図 3) (GUI) でアクセス可能なプログラムされたコンダクタンスと HN(7) ニューロンの HN リアルタイム モデルの電流をリアルタイムで動的クランプで実装および変更します。注:リマインダーとして 、 および持続Na+ 電流(IP)と最大ポンプ電流(Iポンプ)の最大の伝導度です。 ソフトウェアの GUI 入力ボックスを使用して、モデルの実行中に (PumpMaxL ボックス) および (GpinHNLive ボックス) (図 3)を変更します。注: GUI 入力ボックスは型指定された値を受け入れ、0.1 nA のステップを推奨 し、1 nS のステップを推奨 します。 図1Ciiに示すように、微小電極誘発リークによって弱まるHN(7)ニューロンの破裂を安定させるために、少量のダイナミッククランプを加える。注:鋭い微小電極の貫通は、漏れ伝導度の増加または入力抵抗の低下として表現される膜損傷を引き起こします。 マイクロ電極誘発リークを補う0.1-0.2 nAの値を加算することから始めるが、興奮性を低下させ、その後徐々に増加し 、通常の破裂が続くまで、興奮性が増加し、通常は ~1-4 nSである(図4A)。 動的クランプを使用して記録されたHN(7)ニューロンにこれらの電流(0.1 nAの増分と1 nSの増分)を体系的に共に変化 させ、バースト特性に及ぼす影響を評価する:スパイク周波数(f:バースト中のインタースパイク間隔の平均の逆数)、インターバースト間隔(IBI:次のバーストの最初のスパイクまでの最後のスパイク間の時間) バースト期間(BD:バーストの最初のスパイクとバーストの最後のスパイクの間の時間)、バースト期間(T:バーストの最初のスパイクと後続のバーストの最初のスパイクの間の時間)。 と の値 を変更して、ビデオ デモのように、この手法に慣れてから、冒険を始めます。 特定の固定値で保持し、通常のバースト活動をサポートする範囲にわたって 1 nS 単位でスイープ します。 0.1 nA の固定値を増やし、定期的なバースト活動をサポートする範囲を再びスイープ します。 実装されたパラメータペアごとに、少なくとも8つのバーストを含むデータを収集して、f、IBI、BD、およびTの信頼性の高い平均測定値を作成できるようにします。 強いスパイクと振動の安定したベースライン電位によって評価されるように、ニューロンが生存可能である限り、スイープを続けます。 複数のニューロンからデータを収集 (異なる動物から) 合成グラフを生成する (図 5)。