İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Doğal Killer (NK) hücreleri anti-tümör ve anti-viral tepkiler aracılık doğuştan lenfositler vardır. NK hücreleri insan periferik kantüm lenfositlerin% 5-15’ini oluşturur, ve dalak bulunabilir, karaciğer, kemik iliği ve lenf düğümleri. NK hücreleri, T-hücre reseptörleri (TCR) veya B-hücre reseptörleri (BCR) gibi polimorfik klodik reseptörleri ifade etmez. Buna karşılık, onların sitolitik fonksiyonların aktivasyonu bir hedef hücre yüzeyinde değişken ligandlar tanımak reseptörlerinin katılımı ile istenir^1,2.

Periferik kandan izole edilmiş istirahat insan NK hücreleri insan serumu ile desteklenen kültür ortamında birkaç gün hayatta kalabilir. IL-15 veya IL-2 gibi sitokinler tarafından NK hücrelerinin aktivasyonu çoğalması ve öldürme yeteneğinin bir artış için hücreleri sürücüler, diğer etkileri arasında^3,4,5. Çeşitli çalışmalar NK hücre aktivasyonu ve metabolik aktivite değişiklikleri arasında doğrudan bir korelasyon göstermiştir⁶. Bu metabolik değişiklikler enerji ve biyosentez açısından hücrelerin özel gereksinimlerini karşılamak için mukadder.

Aerobik hücreler ve organizmalar katabolizma ve karbonhidrat, yağ ve proteinlerin oksidasyon içeren kimyasal reaksiyonlar bir dizi yoluyla enerji elde. Glikoliz, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon kombinasyonu sayesinde ökaryotik hücreler ATP talebinin büyük bir kısmını karşılar ve hücre büyümesi ve çoğalması için gerekli olan makromoleküller için yapı taşları olarak gerekli ara ları elde ederler. Glikoli (Şekil 1A) hücreye glikoz girişi ile başlar. Sitosolda glikoz fosforilasyona ve pirüvatöre dönüştürülür (glukoz molekülü başına 2 kat atp net üretimi ile), laktat indirgenebilir veya asetil-CoA’ya dönüştürülmek üzere mitokondriye taşınabilir ve TCA döngüsüne girer. TCA döngüsü asetil-CoA daha molekülleri ile yakıt lı bisiklet devam ediyor ve CO₂ üretir (sonunda hücre dışında yayılır ve, orta H₂O ile tepki vererek, orta asitleşme yol açacaktır karbonik asit üretecek) ve NADH, elektron taşıma zincirine elektron bağışı sorumlu molekül (ETC). Elektronlar farklı protein kompleksleri ile seyahat ve nihayet oksijen tarafından kabul edilir. Bu kompleksler (I, III ve IV) mitokondriyal matristen membranlar arası uzaya H⁺ pompalar. Üretilen elektrokimyasal degradenin bir sonucu olarak, H⁺ karmaşık V (ATP-synthase) aracılığıyla matristekrar girecek, POTANSIYEL enerji ATP üretimi içine birikmiş yatırım.

Hem glikoliz hem de mitokondriyal solunum inhibitörleri kullanılarak farklı noktalarda engellenebilir. Bu inhibitörlerin bilgisi ve kullanımı hücre dışı akı testinin geliştirilmesinin temelini oluşturmuştur. Hücre dışı akı analizörü, pH ve oksijen gibi iki basit parametreyi gerçek zamanlı olarak ölçerek glikoliz ve mitokondriyal solunum oranını 96 kuyulu bir plakada algılar. Glikoliz stres testi glikozsuz bazal bir ortamda yapılır (Şekil 1B)⁷. Hücre dışı asitleşme hızının (ECAR) ilk ölçümleri glikoliden bağımsız asitleşmenin göstergesidir. Glikolitik olmayan asitleşme olarak adlandırılır ve TCA tarafından üretilen CO₂ ile ilişkilidir ve daha önce de açıklandığı gibi, H⁺ (TCA’ya bağlı ECAR) üretmek için ortamda H₂O ile birleşir. İlk enjeksiyon glikoz kullanımını teşvik etmek ve glikoli artırmak için glikoz olduğunu. İkinci enjeksiyon her iki rotenon birleştirir, karmaşık bir I inhibitörü, ve antimisin A, Kompleks III inhibitörü birlikte, ETC hücreleri hücresel ATP düzeylerini korumak için glikoliz aktive ederek mitokondriyal ATP üretiminde bu dramatik azalmaya yanıt, ve bu bazal durumda hücre tarafından kullanılmayan glikoliz miktarını temsil eder ama potansiyel ATP talep artışlara yanıt olarak işe olabilir (compens compentory glycos). Üçüncü enjeksiyon glukoz analog udur 2-Deoksiglukoz (DG), hangi enzim hekkokinaz için bir substrat olarak glikoz ile rekabet. Bu fosforilasyonun ürünü olan 2-deoksiglukoz-6-fosfat pirüvata dönüştürülemez ve bu nedenle glikoliz bloke edilir ve bu da ECAR’ı minimuma indirir. Bu noktada ölçülen ECAR glikoliz veya solunum aktivitesi ne kadar az kalıntı glikoliz tam olarak 2-DG tarafından inhibe olmayan diğer ekstrasellüler asitleşme kaynaklarını içerir (post 2-DG-asitleşme).

Mitokondriyal stres testi glikozlu bir ortamda yapılır (Şekil 1C)⁸. Oksijen tüketim hızının (OCR) ilk ölçümleri mitokondriyal solunumun (bazal solunum) taban çizgisine karşılık gelir. İlk enjeksiyon, ATP synthase (kompleks V) yoluyla protonların dönüşünü engelleyen, ATP sentezini engelleyen ve böylece solunum kompleksleri yoluyla daha fazla proton pompalanmasını önleyen mitokondriyal membranı hızla hiperpolarize eden ve OCR’de azalmaya yol açan oligomisindir. Temel solunum ile oligomisin ilavesi ile verilen değer arasındaki karşılaştırma ATP’ye bağlı solunumu temsil eder. Oksijen tüketiminin kalan oligomisin duyarsız oranı proton sızıntısı denir, hangi adenin nükleotid translocase gibi iç mitokondriyal membran lipid bilayer veya proteinler yoluyla proton akışını temsil eder⁹. İkinci enjeksiyon uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), mitokondriyal matriks içine H⁺ büyük bir giriş indükler bir iyonofor, mitokondriyal membran depolarizasyon ve mitokondriyal ATP sentezinin bozulmasına yol açar. Hücreler membran potansiyelini (maksimal solunum kapasitesi) kurtarmak için beyhude bir girişim de elektron taşıma ve oksijen tüketimi oranını maksimum seviyelere artırarak proton-güdük kuvvetin dağılmasına yanıt verir. Maksimal solunum kapasitesi ve bazal solunum arasındaki fark hücrenin yedek solunum kapasitesi, bazal durumda ATP üretmek için hücre tarafından kullanılmayan solunum miktarını temsil eder ama potansiyel OLARAK ATP talebi artışlara yanıt olarak işe olabilir⁸. Üçüncü enjeksiyon rotenon ve antimisin A bir kombinasyonudur. Bu enjeksiyon ETC’yi tamamen durdurur ve OCR en düşük seviyesine iner, kalan oksijen tüketimi mitokondriyal değildir (NADPH-oksidazların neden olduğu vb.).

Metabolik yollardaki değişiklikler bir şekilde NK hücrelerinin işleyişini tahmin edebilir, bu in vitro sitokinler ile NK hücrelerinin sürekli aktivasyonu farklı metabolik yollar 10 çalışma ile NK hücre yorgunluğu yol açabileceği ileri sürülmüştür^10,11. NK hücremetabolik durumu ve fonksiyonu arasındaki korelasyon kanser immünoterapisi açısından çok önemlidir. Bu alanda, IL-15 infüzyonu ile NK hücrelerinin aktivasyonu, tek başına veya monoklonal terapötik antikorlar ile birlikte tümör hücre öldürme geliştirmek için test edilmiştir^12,13,14. Bu tedavi stratejilerine yanıt olarak NK hücrelerinin metabolik durumunun bilinmesi, NK hücre aktivasyon durumunun ve öldürme fonksiyonunun değerli bir belirleyicisini sağlayacaktır.

Monosit, T ve B hücreleri gibi diğer miyeloid ve lenfoid hücrelerde metabolik yolların çalışması¹⁵ tanımlanmış ve optimize edilmiş yöntemler¹⁶olarak yayınlanmıştır. Bu protokolde, hem yüksek sayıda saf ve canlı NK hücresi sağlayan bir NK izolasyon protokolünü hem de hücre dışı akı analizörü kullanarak metabolik aktiviteyi ölçmek için optimize edilmiş bir protokolü birleştiren bir yöntem salıyoruz. Burada bu istirahat ve IL-15 aktif insan NK hücrelerinde metabolik değişikliklerin çalışması için geçerli bir yöntem olduğunu göstermektedir. Hücre dışı akı testi için, hücre numarası ve ilaç konsantrasyonları gibi parametreler test edilmiş ve optimize edilmiştir. Diğer solunum yöntemi ile karşılaştırıldığında, ekstrasellüler akı analizörü tam otomatik ve gerçek zamanlı olarak test etmek mümkün, hücrelerin çok düşük miktarlarda, aynı anda 92 örnek, ve böylece nispeten hızlı bir şekilde yüksek iş çıkışları taramaları sağlar (birden fazla örnek ve çoğaltmalar ile)¹⁷.

Bu yöntem NK hücre metabolizması inceleyerek NK hücre fonksiyonunu değerlendirmek isteyen araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Diğer sitokinler, antikorlar veya çözünür uyaranlar tarafından aktive edilen hücrelere de uygulanabilir.