Summary

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Published: June 22, 2020
doi:

Summary

Bu yazıda, periferik kandan izole edilen primer insan Doğal Öldürücü (NK) hücrelerinde glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem, istirahatte veya IL15 kaynaklı aktivasyonu takiben açıklıyoruz. Açıklanan protokol kolayca birincil insan NK hücreleri diğer sitokinler veya çözünür uyaranlar tarafından aktive genişletilebilir.

Abstract

Doğal Killer (NK) hücreleri esas olarak doğuştan gelen anti-tümör ve anti-viral immün yanıtlar aracılık ve sağkalım teşvik etmek sitokinler ve diğer uyaranların çeşitli yanıt, hücresel çoğalma, interferon gama gibi sitokinlerin üretimi (IFNγ) ve / veya sitotoksisite programları. Sitokin stimülasyon ile NK hücre aktivasyonu onların biyoenerjik ve biyosentetik gereksinimlerini desteklemek için metabolik yolların önemli bir remodeling gerektirir. Bozulmuş NK hücre metabolizmasının obezite ve kanser de dahil olmak üzere kronik hastalıkların bir dizi ile ilişkili olduğunu düşündüren kanıtlar büyük bir vücut vardır, Hangi NK hücre metabolizmasını belirlemek için bir yöntemin kullanılabilirliğinin klinik önemini vurgulamaktadır. Burada, insan NK hücrelerinin enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir araç olarak glikoliz ve mitokondriyal oksijen tüketiminin gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanıyan bir platform olan hücre dışı akı analizörü nün kullanımını açıklıyoruz. Burada açıklanan yöntem aynı zamanda il-15 gibi sitokinler ile NK hücrelerinin uyarılmasından sonra metabolik değişikliklerin izlenmesi için izin verir, şu anda klinik çalışmaların geniş bir yelpazede araştırılmaktadır bir sistem.

Introduction

Doğal Killer (NK) hücreleri anti-tümör ve anti-viral tepkiler aracılık doğuştan lenfositler vardır. NK hücreleri insan periferik kantüm lenfositlerin% 5-15’ini oluşturur, ve dalak bulunabilir, karaciğer, kemik iliği ve lenf düğümleri. NK hücreleri, T-hücre reseptörleri (TCR) veya B-hücre reseptörleri (BCR) gibi polimorfik klodik reseptörleri ifade etmez. Buna karşılık, onların sitolitik fonksiyonların aktivasyonu bir hedef hücre yüzeyinde değişken ligandlar tanımak reseptörlerinin katılımı ile istenir1,2.

Periferik kandan izole edilmiş istirahat insan NK hücreleri insan serumu ile desteklenen kültür ortamında birkaç gün hayatta kalabilir. IL-15 veya IL-2 gibi sitokinler tarafından NK hücrelerinin aktivasyonu çoğalması ve öldürme yeteneğinin bir artış için hücreleri sürücüler, diğer etkileri arasında3,4,5. Çeşitli çalışmalar NK hücre aktivasyonu ve metabolik aktivite değişiklikleri arasında doğrudan bir korelasyon göstermiştir6. Bu metabolik değişiklikler enerji ve biyosentez açısından hücrelerin özel gereksinimlerini karşılamak için mukadder.

Aerobik hücreler ve organizmalar katabolizma ve karbonhidrat, yağ ve proteinlerin oksidasyon içeren kimyasal reaksiyonlar bir dizi yoluyla enerji elde. Glikoliz, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon kombinasyonu sayesinde ökaryotik hücreler ATP talebinin büyük bir kısmını karşılar ve hücre büyümesi ve çoğalması için gerekli olan makromoleküller için yapı taşları olarak gerekli ara ları elde ederler. Glikoli (Şekil 1A) hücreye glikoz girişi ile başlar. Sitosolda glikoz fosforilasyona ve pirüvatöre dönüştürülür (glukoz molekülü başına 2 kat atp net üretimi ile), laktat indirgenebilir veya asetil-CoA’ya dönüştürülmek üzere mitokondriye taşınabilir ve TCA döngüsüne girer. TCA döngüsü asetil-CoA daha molekülleri ile yakıt lı bisiklet devam ediyor ve CO2 üretir (sonunda hücre dışında yayılır ve, orta H2O ile tepki vererek, orta asitleşme yol açacaktır karbonik asit üretecek) ve NADH, elektron taşıma zincirine elektron bağışı sorumlu molekül (ETC). Elektronlar farklı protein kompleksleri ile seyahat ve nihayet oksijen tarafından kabul edilir. Bu kompleksler (I, III ve IV) mitokondriyal matristen membranlar arası uzaya H+ pompalar. Üretilen elektrokimyasal degradenin bir sonucu olarak, H+ karmaşık V (ATP-synthase) aracılığıyla matristekrar girecek, POTANSIYEL enerji ATP üretimi içine birikmiş yatırım.

Hem glikoliz hem de mitokondriyal solunum inhibitörleri kullanılarak farklı noktalarda engellenebilir. Bu inhibitörlerin bilgisi ve kullanımı hücre dışı akı testinin geliştirilmesinin temelini oluşturmuştur. Hücre dışı akı analizörü, pH ve oksijen gibi iki basit parametreyi gerçek zamanlı olarak ölçerek glikoliz ve mitokondriyal solunum oranını 96 kuyulu bir plakada algılar. Glikoliz stres testi glikozsuz bazal bir ortamda yapılır (Şekil 1B)7. Hücre dışı asitleşme hızının (ECAR) ilk ölçümleri glikoliden bağımsız asitleşmenin göstergesidir. Glikolitik olmayan asitleşme olarak adlandırılır ve TCA tarafından üretilen CO2 ile ilişkilidir ve daha önce de açıklandığı gibi, H+ (TCA’ya bağlı ECAR) üretmek için ortamda H2O ile birleşir. İlk enjeksiyon glikoz kullanımını teşvik etmek ve glikoli artırmak için glikoz olduğunu. İkinci enjeksiyon her iki rotenon birleştirir, karmaşık bir I inhibitörü, ve antimisin A, Kompleks III inhibitörü birlikte, ETC hücreleri hücresel ATP düzeylerini korumak için glikoliz aktive ederek mitokondriyal ATP üretiminde bu dramatik azalmaya yanıt, ve bu bazal durumda hücre tarafından kullanılmayan glikoliz miktarını temsil eder ama potansiyel ATP talep artışlara yanıt olarak işe olabilir (compens compentory glycos). Üçüncü enjeksiyon glukoz analog udur 2-Deoksiglukoz (DG), hangi enzim hekkokinaz için bir substrat olarak glikoz ile rekabet. Bu fosforilasyonun ürünü olan 2-deoksiglukoz-6-fosfat pirüvata dönüştürülemez ve bu nedenle glikoliz bloke edilir ve bu da ECAR’ı minimuma indirir. Bu noktada ölçülen ECAR glikoliz veya solunum aktivitesi ne kadar az kalıntı glikoliz tam olarak 2-DG tarafından inhibe olmayan diğer ekstrasellüler asitleşme kaynaklarını içerir (post 2-DG-asitleşme).

Mitokondriyal stres testi glikozlu bir ortamda yapılır (Şekil 1C)8. Oksijen tüketim hızının (OCR) ilk ölçümleri mitokondriyal solunumun (bazal solunum) taban çizgisine karşılık gelir. İlk enjeksiyon, ATP synthase (kompleks V) yoluyla protonların dönüşünü engelleyen, ATP sentezini engelleyen ve böylece solunum kompleksleri yoluyla daha fazla proton pompalanmasını önleyen mitokondriyal membranı hızla hiperpolarize eden ve OCR’de azalmaya yol açan oligomisindir. Temel solunum ile oligomisin ilavesi ile verilen değer arasındaki karşılaştırma ATP’ye bağlı solunumu temsil eder. Oksijen tüketiminin kalan oligomisin duyarsız oranı proton sızıntısı denir, hangi adenin nükleotid translocase gibi iç mitokondriyal membran lipid bilayer veya proteinler yoluyla proton akışını temsil eder9. İkinci enjeksiyon uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), mitokondriyal matriks içine H+ büyük bir giriş indükler bir iyonofor, mitokondriyal membran depolarizasyon ve mitokondriyal ATP sentezinin bozulmasına yol açar. Hücreler membran potansiyelini (maksimal solunum kapasitesi) kurtarmak için beyhude bir girişim de elektron taşıma ve oksijen tüketimi oranını maksimum seviyelere artırarak proton-güdük kuvvetin dağılmasına yanıt verir. Maksimal solunum kapasitesi ve bazal solunum arasındaki fark hücrenin yedek solunum kapasitesi, bazal durumda ATP üretmek için hücre tarafından kullanılmayan solunum miktarını temsil eder ama potansiyel OLARAK ATP talebi artışlara yanıt olarak işe olabilir8. Üçüncü enjeksiyon rotenon ve antimisin A bir kombinasyonudur. Bu enjeksiyon ETC’yi tamamen durdurur ve OCR en düşük seviyesine iner, kalan oksijen tüketimi mitokondriyal değildir (NADPH-oksidazların neden olduğu vb.).

Metabolik yollardaki değişiklikler bir şekilde NK hücrelerinin işleyişini tahmin edebilir, bu in vitro sitokinler ile NK hücrelerinin sürekli aktivasyonu farklı metabolik yollar 10 çalışma ile NK hücre yorgunluğu yol açabileceği ileri sürülmüştür10,11. NK hücremetabolik durumu ve fonksiyonu arasındaki korelasyon kanser immünoterapisi açısından çok önemlidir. Bu alanda, IL-15 infüzyonu ile NK hücrelerinin aktivasyonu, tek başına veya monoklonal terapötik antikorlar ile birlikte tümör hücre öldürme geliştirmek için test edilmiştir12,13,14. Bu tedavi stratejilerine yanıt olarak NK hücrelerinin metabolik durumunun bilinmesi, NK hücre aktivasyon durumunun ve öldürme fonksiyonunun değerli bir belirleyicisini sağlayacaktır.

Monosit, T ve B hücreleri gibi diğer miyeloid ve lenfoid hücrelerde metabolik yolların çalışması15 tanımlanmış ve optimize edilmiş yöntemler16olarak yayınlanmıştır. Bu protokolde, hem yüksek sayıda saf ve canlı NK hücresi sağlayan bir NK izolasyon protokolünü hem de hücre dışı akı analizörü kullanarak metabolik aktiviteyi ölçmek için optimize edilmiş bir protokolü birleştiren bir yöntem salıyoruz. Burada bu istirahat ve IL-15 aktif insan NK hücrelerinde metabolik değişikliklerin çalışması için geçerli bir yöntem olduğunu göstermektedir. Hücre dışı akı testi için, hücre numarası ve ilaç konsantrasyonları gibi parametreler test edilmiş ve optimize edilmiştir. Diğer solunum yöntemi ile karşılaştırıldığında, ekstrasellüler akı analizörü tam otomatik ve gerçek zamanlı olarak test etmek mümkün, hücrelerin çok düşük miktarlarda, aynı anda 92 örnek, ve böylece nispeten hızlı bir şekilde yüksek iş çıkışları taramaları sağlar (birden fazla örnek ve çoğaltmalar ile)17.

Bu yöntem NK hücre metabolizması inceleyerek NK hücre fonksiyonunu değerlendirmek isteyen araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Diğer sitokinler, antikorlar veya çözünür uyaranlar tarafından aktive edilen hücrelere de uygulanabilir.

Protocol

Tüm deneyler Helsinki’nin etik tıbbi araştırma ilkelerine uygun olarak yapılmıştır. 99-CC-0168 IRB onaylı protokol kapsamında, hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı ile NIH Transfüzyon Tıbbı Bölümü’nden donörlerden periferik kan örnekleri alındı. 1. Reaktif hazırlama NK hücrelerinin izolasyonu için reaktiflerNOTLAR: Bu reaktifleri hücre kültürü başlığında hazırlayın. NK ayırma tamponu hazırlayın: Daha önce ıs…

Representative Results

NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu saf ve canlı bir popülasyon sağlar Hücre dışı akı teşpini kuyudaki H+ ve O2 konsantrasyonunun ölçümü ne dayanır ve farklı hücre popülasyonları veya canlılıkları arasında ayrım yapmaz. Bu nedenle, ilgi hücresinin son derece saf ve canlı bir nüfus elde etmek bu deneylerde başarılı olmak için önemli bir adım oldu. NK hücrelerinin periferik kandan izolasy…

Discussion

Bu yazıda, saf ve canlı birincil insan NK hücrelerini periferik kandan verimli bir şekilde izole etmek ve elde etmek için bir protokol oluşturduk. Ayrıca, oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranı ile değerlendirilen bu NK hücrelerinin metabolik aktivitesinin ölçümü için koşulları da ekstrasellüler akı analizörü kullanarak optimize ettik. Diğer solunum yöntemleri ile karşılaştırıldığında, hücre dışı akı analizörü hızlıdır, az sayıda hücre gerektirir ve yüksek iş ak?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar destek ve tartışma için Dr Michael N. Sack (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü) teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programları tarafından desteklenmiştir. JT MICINN (İspanya) Ramon y Cajal programı (hibe RYC2018-026050-I) tarafından desteklenir.

Materials

2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O’Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Play Video

Cite This Article
Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

View Video