ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析
Summary
本論文では、末梢血から分離されたヒトナチュラルキラー(NK)細胞の解糖とミトコンドリア呼吸を、静止状態またはIL15誘発活性化後に測定する方法について述べた。記載されたプロトコルは、他のサイトカインまたは可溶性刺激によって活性化された初代ヒトNK細胞に容易に拡張することができる。
Abstract
ナチュラルキラー(NK)細胞は、主に自然な抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答を媒介し、生存、細胞増殖、インターフェロンガンマ(IFNγ)および/または細胞毒性プログラムなどのサイトカインの産生を促進するために、様々なサイトカインおよび他の刺激に応答する。サイトカイン刺激によるNK細胞活性化は、その生体エネルギーおよび生合成の要件をサポートするために代謝経路の実質的なリモデリングを必要とする。NK細胞代謝障害は、肥満やがんを含む多くの慢性疾患に関連していることを示唆する大きな証拠があり、NK細胞代謝を決定する方法の利用可能性の臨床的重要性を強調している。ここでは、ヒトNK細胞のエネルギー代謝の変化を監視するツールとして、糖分解とミトコンドリア酸素消費量のリアルタイム測定を可能にする細胞外フラックス分析装置の使用について説明します。ここで説明する方法は、現在、広範囲の臨床試験で調査されているシステムであるIL-15などのサイトカインを用いたNK細胞の刺激後の代謝変化のモニタリングも可能にする。
Introduction
ナチュラルキラー(NK)細胞は、抗腫瘍および抗ウイルス応答を媒介する生来のリンパ球である。NK細胞は、ヒト末梢血中の全リンパ球の5~15%を含み、脾臓、肝臓、骨髄およびリンパ節にも含まれる。NK細胞は、T細胞受容体(TCR)やB細胞受容体(BCR)などの多形性クロオチピッレセプターを発現しない。対照的に、それらの細胞分解機能の活性化は、標的細胞11,22の表面上の不変リガンドを認識する受容体の関与によって促される。
末梢血から分離されたヒトNK細胞は、ヒト血清を添加した培地で数日間生存することができる。IL-15やIL-2などのサイトカインによるNK細胞の活性化は、細胞を増殖させ、その殺滅能力の増加に駆り立て、他の効果の中でも,3、4、5。,5いくつかの研究は、NK細胞活性化と代謝活性の変化との間に直接的な相関関係を示している6.これらの代謝変化は、エネルギーと生合成の観点から細胞の特定の要件を満たす運命にある。
好気性細胞や生物は、炭水化物、脂肪、タンパク質の異化と酸化を伴う一連の化学反応を通じてエネルギーを得る。解糖、三カルボン酸(TCA)サイクルと酸化リン酸化を組み合わせて、真核生物細胞はATPの需要の大半を満たし、細胞増殖および増殖に不可欠な高分子のビルディングブロックとして必要な中間体を得る。解糖のプロセス(図1A)は、細胞内のグルコースの侵入から始まります。細胞質では、グルコースはリン酸化され、ピルビン酸(グルコース分子あたり2分子のATPの正味生産)に変換され、乳酸に還元したり、ミトコンドリアに輸送してアセチルCoAに変換してTCAサイクルに入ることができます。TCAサイクルは、アセチルCoAのより多くの分子を燃料としてサイクリングを続け、CO2 を生成します(最終的には細胞の外に拡散し、培地中でH2Oと反応することによって、培地の酸性化につながる炭酸を生成します)とNADHは、電子輸送鎖に電子を寄付する分子(ETC)。。電子は異なるタンパク質複合体を通過し、最終的に酸素によって受け入れられます。これらの複合体(I、IIIおよびIV)も、ミトコンドリアマトリックスから膜間空間にH+ をポンプする。生成された電気化学的勾配の結果として、H+ は、ATPの生成に蓄積された潜在的なエネルギーを投資する、複雑なV(ATP-シンターゼ)を介してマトリックスに再び入ります。
解糖とミトコンドリア呼吸の両方は、阻害剤を使用することによって異なる点で遮断することができます。これらの阻害剤の知識と使用法は、細胞外フラックスアッセイの開発の基礎となった。pHや酸素などの2つの単純なパラメータをリアルタイムで測定することにより、細胞外フラックス分析装置は、96ウェルプレートにおける解糖およびミトコンドリア呼吸の速度を推測します。解糖解析ストレス試験は、グルコースを含まない基底培地(図1B)7で行7われる。細胞外酸性化率(ECAR)の最初の測定は、解糖非依存性酸性化を示す。非解糖酸化と呼ばれ、TCAによって産生されるCO2と相関し、前述のように、培地中のH2Oと結合してH+(TCA結合ECAR)を生成する。最初の注射は、グルコースの利用を誘導し、解糖を高めるためにグルコースです。2回目の注射は、両方のロテノーネを組み合わせた、 複合体I阻害剤と、複合体III阻害剤であるアンチマイシンAは、細胞の細胞ATPレベルを維持するために解糖分解を活性化することによって、このミトコンドリアATP産生の劇的な減少に応答するETC.細胞をブロックし、これは基底状態の細胞によって使用されないが、ATP需要の増加に応じて潜在的に採用することができる解糖の量を表す(コンペンサ第3の注射は、グルコースアナログ2-デオキシグルコース(DG)であり、これは、酵素ヘキソキナーゼの基質としてグルコースと競合する。このリン酸化の産物である2-デオキシグルコース-6-リン酸はピルビン酸に変換できないため、解糖が遮断され、ECARが最小限に下がります。この時点で測定されたECARには、解糖または呼吸活性に起因しない他の細胞外酸性化源と、2-DG(ポスト2-DG酸化)によって完全に阻害されない残留解糖が含まれる。
ミトコンドリアストレス試験は、グルコースを有する培地(図1C)8で8行われる。酸素消費率(OCR)の最初の測定は、ミトコンドリア呼吸の基本線(基底呼吸)に対応しています。最初の注射は、ATP合成酵素(複合V)を介して陽子の戻りを阻害するオリゴマイシンであり、ATP合成を遮断し、したがってミトコンドリア膜を急速に過分極し、呼吸複合体を通して更にプロトンのポンピングを防ぎ、OCRの減少をもたらす。ベースライン呼吸とオリゴマイシンの添加によって与えられた値との比較は、ATP結合呼吸を表す。酸素消費量の残りのオリゴマイシン無感率はプロトンリークと呼ばれ、これはアデニンヌクレオチドトランスロケース9のようなミトコンドリア膜内の脂質二重層またはタンパク質を通るプロトンの流れを表す。第二の注射は、アンカプラー2,4-ジニトロフェノール(DNP)、ミトコンドリアマトリックスへのH+の大量の侵入を誘発するイオノフォアであり、ミトコンドリア膜の脱分極化およびミトコンドリアATP合成の破壊につながる。細胞は、膜電位(最大呼吸能力)を回復しようとする無駄な試みにおいて、電子輸送速度と酸素消費量を最大レベルに増加させることによって、プロトン動機力の消滅に反応する。最大呼吸能力と基底呼吸の違いは、細胞の予備呼吸能力であり、これは細胞が基礎状態でATPを生成するために使用しない呼吸量を表すが、ATP需要の増加に応じて、またはストレス8の条件下で潜在的に募集することができる。3回目の注射はロテノーネとアンチマイシンAの組み合わせです。この注射は、ETCとOCRが最も低いレベルに完全に減少し、残りの酸素消費量は非ミトコンドリア(NADPH-オキシダーゼなどによって引き起こされる)になります。
代謝経路の変化は、インビトロでサイトカインを用いたNK細胞の連続的な活性化が、異なる代謝経路10,11の研究によってNK細胞枯渇を引き起こす可能性が示唆されているので、11何らかの形でNK細胞の機能を予測することができた。NK細胞の代謝状態と機能の相関は、がん免疫療法の観点から非常に重要です。この分野では、IL-15の注入を伴うNK細胞の活性化は、単独で、またはモノクローナル治療抗体と組み合わせて、腫瘍細胞死死を改善するために試験されている12、13、14。,1412,これらの治療戦略に応じてNK細胞の代謝状態に関する知識は、NK細胞活性化状態および殺死機能の貴重な予測を提供するであろう。
単球などの他の骨髄系およびリンパ球細胞における代謝経路の研究は、TおよびB細胞が15と記載されており、最適化された方法が16に公表されている。このプロトコルでは、大量の純粋かつ生存可能なNK細胞を生成するNK絶縁プロトコルと、細胞外フラックス分析装置を用いて代謝活性を測定するための最適化されたプロトコルの両方を組み合わせた方法を提供する。ここでは、安静細胞およびIL-15活性化ヒトNK細胞の代謝変化の研究に有効な方法であることを示す。細胞外フラックスアッセイでは、細胞数や薬剤濃度などのパラメータがテストされ、最適化されています。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は完全に自動化されており、非常に少量の細胞を同時に、最大92サンプルでリアルタイムでテストすることができ、比較的迅速な方法で(複数のサンプルと反復で)高スループットスクリーニングを可能にする17。
NK細胞代謝を研究することでNK細胞機能を評価する研究者が利用できる。これは、他のサイトカイン、抗体または可溶性刺激によって活性化された細胞にも適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、末梢血から純粋で生存可能な初代ヒトNK細胞を効率的に単離し、培養するためのプロトコルを確立した。また、細胞外フラックス分析装置を用いることで、酸素消費率や細胞外酸性化率で評価したNK細胞の代謝活性測定条件を最適化しました。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は高速であり、少数の細胞を必要とし、高スループットスクリーニングを可能にする…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マイケル・N・サック博士(国立心臓・肺・血液研究所)の支援と議論に感謝する。この研究は、国立衛生研究所、国立がん研究所、国立心臓、肺、血液研究所の壁内研究プログラムによって支援されました。JT は MICINN (スペイン) のラモン y カハル プログラム (助成金 RYC2018-026050-I) によってサポートされています。
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
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