Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l’attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall’impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio^1,2.

Le cellule NK umane a riposo isolate dal sangue periferico possono sopravvivere per diversi giorni in una coltura media integrata con siero umano. L’attivazione delle cellule NK da parte di citochine come IL-15 o IL-2 spinge le cellule alla proliferazione e ad un aumento della loro capacità di^{uccidere, tra}gli altri effetti 3^,4,5. Diversi studi hanno dimostrato una correlazione diretta tra l’attivazione delle cellule NK e i cambiamenti nella loro attività^{metabolica 6}. Questi cambiamenti metabolici sono destinati a soddisfare i particolari requisiti delle cellule in termini di energia e biosintesi.

Le cellule e gli organismi aerobici ottengono energia attraverso una serie di reazioni chimiche che coinvolgono il catabolismo e l’ossidazione di carboidrati, grassi e proteine. Attraverso una combinazione di glicolisi, ciclo di acido tricarboxylico (TCA) e fosforilazione ossidativa, le cellule eucariotiche soddisfano la maggior parte della loro domanda ATP e ottengono gli intermedi necessari come elementi costitutivi per le macromolecole essenziali per la crescita e la proliferazione delle cellule. Il processo di glicolysis (Figura 1A) inizia con l’immissione di glucosio nella cella. Nel citosol, il glucosio viene fosforiato e trasformato in piruvato (con una produzione netta di 2 molecole di ATP per molecola di glucosio), che può essere ridotto a lattato o trasportato nei mitocondri per essere trasformato in Acetil-CoA ed entrare nel ciclo TCA. Il ciclo TCA continua a pedalare alimentato con più molecole di Acetil-CoA e produce CO₂ (che alla fine si diffonderà al di fuori della cellula e, reagendo con H₂O nel mezzo, genererà acido carbonico che porterà all’acidificazione del mezzo) e NADH, la molecola incaricata di donare elettroni alla catena di trasporto elettronico (ETC). Gli elettroni viaggiano attraverso diversi complessi proteici e sono finalmente accettati dall’ossigeno. Questi complessi (I, III e IV) pompano anche H^– dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Come conseguenza del gradiente elettrochimico generato,^l’H – entreranno di nuovo nella matrice attraverso il complesso V (ATP-synthase), investendo l’energia potenziale accumulata nella generazione di ATP.

Sia la glicolysis che la respirazione mitocondriale possono essere bloccate in punti diversi utilizzando inibitori. La conoscenza e l’uso di questi inibitori è stata la base per lo sviluppo del flusso extracellulare. Misurando due semplici parametri in tempo reale come il pH e l’ossigeno, l’analizzatore di flusso extracellulare deduce il tasso di glicolysi e respirazione mitocondriale in una piastra a 96 ben. Il test di stress della glicolysi viene eseguito in un mezzo basale senza glucosio (Figura 1B)⁷. Le prime misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono indicative dell’acidificazione indipendente dalla glicosisi. Si riferisce come acidificazione non glicolicotica e correla con CO₂ prodotto dal TCA che, come spiegato in precedenza, si combina con H₂O nel mezzo per^generare H (ECAR collegato alla TCA). La prima iniezione è glucosio per indurre l’utilizzo del glucosio e aumentare la glicolysis. La seconda iniezione combina sia rotenone, un inibitore I complesso, e antimicina A, un inibitore Complex III insieme, per bloccare l’ETC. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP mitocondriale attivando la glicolysis per mantenere i livelli di ATP cellulare, e questo rappresenta la quantità di glicolisi che non viene utilizzata dalla cellula nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta agli aumenti della domanda di ATP (compensatore). La terza iniezione è il glucosio analogico 2-Deoxyglucose (DG), che compete con il glucosio come substrato per l’esochinasi enzimatica. Il prodotto di questa fosforilazione, 2-deossiglucosio-6-fosfato non può essere trasformato in piruvato, e quindi la glicolysis è bloccata, che abbassa l’ECAR al suo minimo. L’ECAR misurato a questo punto comprende altre fonti di acidificazione extracellulare che non sono attribuite alla glicoolisi o all’attività respiratoria, nonché qualsiasi glicolisi residua non completamente inibita da 2-DG (post 2-DG-acidificazione).

Il test di stress mitocondriale viene eseguito in un mezzo con glucosio (Figura 1C^{) 8}. Le prime misurazioni del tasso di consumo di ossigeno (OCR) corrispondono alla linea di base della respirazione mitocondriale (respirazione basale). La prima iniezione è l’oligomicina, che inibisce il ritorno dei protoni attraverso la sintesi ATP (V complesso), bloccando la sintesi ATP e quindi iperpolarizzare rapidamente la membrana mitocondriale, che impedisce un ulteriore pompaggio di protoni attraverso complessi respiratori e porta ad una diminuzione dell’OCR. Il confronto tra la respirazione di base e il valore dato dall’aggiunta di oligomicina rappresenta la respirazione collegata all’ATP. Il rimanente tasso di consumo di ossigeno insensibile all’oligomicina è chiamato perdita di protoni, che rappresenta il flusso di protoni attraverso il bistrato lipidico o le proteine nella membrana mitocondriale interna come il translocase adenina nucleotide⁹. La seconda iniezione è il disaccoppiatore 2,4-dinitrophenol (DNP), un ionoforo che induce un ingresso massiccio di H^– nella matrice mitocondriale, che porta alla depolarizzazione della membrana mitocondriale e interruzione della sintesi ATP mitocondriale. Le cellule rispondono alla dissipazione della forza protone-motivo aumentando il tasso di trasporto di elettroni e consumo di ossigeno ai livelli massimi nel tentativo inutile di recuperare il potenziale della membrana (capacità respiratoria massima). La differenza tra la capacità respiratoria massima e la respirazione basale è la capacità respiratoria di riserva della cellula, che rappresenta la quantità di respirazione che non viene utilizzata dalla cellula per generare ATP nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta all’aumento della domanda di ATP o in condizioni di stress⁸. La terza iniezione è una combinazione di rotenone e antimicina A. Questa iniezione ferma completamente l’ETC e l’OCR diminuisce al suo livello più basso, con il consumo rimanente di ossigeno non mitocondriale (causato da NADPH-oxidasi, ecc.).

I cambiamenti nelle vie metaboliche potrebbero in qualche modo prevedere il funzionamento delle cellule NK, in quanto è stato suggerito che l’attivazione continua delle cellule NK con citochine in vitro potrebbe portare all’esaurimento delle cellule NK dallo studio di diverse vie metaboliche^10,11. La correlazione tra lo stato metabolico delle cellule NK e la funzione è molto importante dal punto di vista dell’immunoterapia del cancro. In questo campo, l’attivazione di cellule NK con infusione di IL-15, da solo o in combinazione con anticorpi terapeutici monoclonali sono stati testati al fine di migliorare l’uccisione delle cellule tumorali^12,13,14. La conoscenza dello stato metabolico delle cellule NK in risposta a queste strategie di trattamento fornirebbe un valido predittore dello stato di attivazione delle cellule NK e della funzione di uccisione.

Lo studio delle vie metaboliche in altre cellule mieloidi e linfoidi come monociti, cellule T e B è stato^{descritto 15} e sono stati pubblicati metodi ottimizzati¹⁶. In questo protocollo forniamo un metodo che combina sia un protocollo di isolamento NK che produce un numero elevato di cellule NK pure e vitali sia un protocollo ottimizzato per misurare l’attività metabolica utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Qui mostriamo che questo è un metodo valido per lo studio dei cambiamenti metabolici nel riposo e IL-15 attivato cellule NK umane. Per il test del flusso extracellulare, sono stati testati e ottimizzati parametri come il numero di cellule e le concentrazioni di farmaci. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l’analizzatore di flusso extracellulare è completamente automatizzato e in grado di testare in tempo reale, con quantità molto basse di cellule, fino a 92 campioni contemporaneamente, e quindi consente screening ad alta velocità effettiva (con più campioni e repliche) in modo relativamente rapido¹⁷.

Questo metodo può essere utilizzato da ricercatori interessati a valutare la funzione cellulare NK studiando il metabolismo delle cellule NK. Potrebbe essere applicato anche alle cellule attivate da altre citochine, anticorpi o stimoli solubili.