Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

Les cellules de tueur naturel (NK) sont des lymphocytes innés qui pédiment les réponses anti-tumorales et antivirales. Les cellules NK représentent 5 à 15 % de tous les lymphocytes dans le sang périphérique humain, et peuvent également être trouvées dans la rate, le foie, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques. Les cellules NK n’expriment pas les récepteurs clonotypic polymorphes, tels que les récepteurs à cellules T (TCR) ou les récepteurs à cellules B (BCR). En revanche, l’activation de leurs fonctions cytolytiques est motivée par l’engagement de récepteurs qui reconnaissent les ligands invariables à la surface d’une cellule cible^1,2.

Les cellules nk humaines au repos isolées du sang périphérique peuvent survivre pendant plusieurs jours dans le milieu de culture complété avec le sérum humain. L’activation des cellules NK par des cytokines telles que l’IL-15 ou l’IL-2 entraîne la prolifération des cellules et une augmentation de leur capacité de tuer, entre autres effets^3,4,5. Plusieurs études ont montré une corrélation directe entre l’activation des cellules NK et les changements dans leur activité métabolique⁶. Ces changements métaboliques sont destinés à répondre aux exigences particulières des cellules en termes d’énergie et de biosynthèse.

Les cellules et les organismes aérobiques obtiennent de l’énergie grâce à une série de réactions chimiques qui impliquent le catabolisme et l’oxydation des glucides, des graisses et des protéines. Grâce à une combinaison de glycolyse, le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, les cellules eucaryotes répondent à la majorité de leur demande d’ATP et obtiennent des intermédiaires requis comme éléments constitutifs des macromolécules essentielles à la croissance et à la prolifération des cellules. Le processus de glycolyse (figure 1A) commence par l’entrée du glucose dans la cellule. Dans le cytosol, le glucose est phosphorylé et transformé en pyruvate (avec une production nette de 2 molécules d’ATP par molécule de glucose), qui peut être réduit au lactate ou transporté dans les mitochondries pour être transformé en Acétyl-CoA et entrer dans le cycle TCA. Le cycle TCA continue le cycle alimenté avec plus de molécules d’Acétyl-CoA et produit du CO₂ (qui finira par se diffuser à l’extérieur de la cellule et, en réagissant avec H₂O dans le milieu, générera de l’acide carbonique qui conduira à l’acidification du milieu) et NADH, la molécule en charge de donner des électrons à la chaîne de transport d’électrons (ETC). Les électrons voyagent à travers différents complexes protéiques et sont finalement acceptés par l’oxygène. Ces complexes (I, III et IV) pompent également H⁺ de la matrice mitochondriale dans l’espace intermembrane. En conséquence du gradient électrochimique généré, le H⁺ entrera à nouveau dans la matrice à travers le complexe V (ATP-synthase), en investissant l’énergie potentielle accumulée dans la génération d’ATP.

La glycolyse et la respiration mitochondriale peuvent être bloquées à différents points en utilisant des inhibiteurs. La connaissance et l’utilisation de ces inhibiteurs ont été la base pour le développement de l’essai de flux extracellulaire. En mesurant deux paramètres simples en temps réel comme le pH et l’oxygène, l’analyseur de flux extracellulaire infère le taux de glycolyse et de respiration mitochondriale dans une plaque de 96 puits. Le test de résistance à la glycolyse est effectué dans un milieu basal sans glucose (Figure 1B)⁷. Les premières mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) sont indicatives de l’acidification indépendante de la glycolyse. Il est appelé acidification non glycolytique et est en corrélation avec le CO₂ produit par le TCA qui, comme expliqué précédemment, se combine avec H₂O dans le milieu pour générer H⁺ (ECAR lié au TCA). La première injection est le glucose pour induire l’utilisation du glucose et stimuler la glycolyse. La deuxième injection combine à la fois la roténone, un inhibiteur du complexe I, et l’antimycine A, un inhibiteur complexe III ensemble, pour bloquer l’ETC. Les cellules répondent à cette diminution spectaculaire de la production d’ATP mitochondrial en activant la glycolyse pour maintenir les niveaux d’ATP cellulaire, ce qui représente la quantité de glycolyse qui n’est pas utilisée par la cellule dans l’état basal mais pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP (glycolyse compensatoiree). La troisième injection est l’analogue du glucose 2-Désoxyglucose (DG), qui rivalise avec le glucose comme substrat pour l’enzyme hexokinase. Le produit de cette phosphorylation, 2-désoxyglucose-6-phosphate ne peut pas être transformé en pyruvate, et donc la glycolyse est bloquée, ce qui abaisse l’ECAR à son minimum. L’ECAR mesurée à ce stade comprend d’autres sources d’acidification extracellulaire qui ne sont pas attribuées à la glycolyse ou à l’activité respiratoire ainsi que toute glycolyse résiduelle non totalement inhibée par 2-DG (post 2-DG-acidification).

Le test de stress mitochondrial est effectué dans un milieu avec du glucose (Figure 1C)⁸. Les premières mesures du taux de consommation d’oxygène (OCR) correspondent à la ligne de base de la respiration mitochondriale (respiration basale). La première injection est l’oligomycine, qui inhibe le retour des protons par la synthase ATP (complexe V), bloquant la synthèse de l’ATP et donc hyperpolariser rapidement la membrane mitochondriale, ce qui empêche le pompage de protons par les complexes respiratoires, et conduit à une diminution de l’OCR. La comparaison entre la respiration de base et la valeur donnée par addition d’oligomycine représente la respiration liée à l’ATP. Le taux restant d’oligomycine insensible à la consommation d’oxygène est appelé fuite de protons, qui représente le flux de protons à travers la bicouche lipidique ou les protéines dans la membrane mitochondriale interne comme le translocale nucléotide adénine⁹. La deuxième injection est le uncoupler 2,4-dinitrophénol (DNP), une ionophore qui induit une entrée massive de H⁺ dans la matrice mitochondriale, ce qui conduit à la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la perturbation de la synthèse mitochondriale ATP. Les cellules réagissent à la dissipation de la force proton-motrice en augmentant le taux de transport des électrons et la consommation d’oxygène à des niveaux maximums dans une tentative futile de récupérer le potentiel de la membrane (capacité respiratoire maximale). La différence entre la capacité respiratoire maximale et la respiration basale est la capacité respiratoire de rechange de la cellule, qui représente la quantité de respiration qui n’est pas utilisée par la cellule pour générer de l’ATP dans l’état basal, mais qui pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP ou dans des conditions de stress⁸. La troisième injection est une combinaison de roténone et d’antimycine A. Cette injection arrête complètement l’ETC et l’OCR diminue à son niveau le plus bas, la consommation d’oxygène restante étant non mitochondriale (causée par les NADPH-oxydases, etc.).

Les changements dans les voies métaboliques pourraient en quelque sorte prédire le fonctionnement des cellules NK, car il a été suggéré que l’activation continue des cellules NK avec des cytokines in vitro pourrait conduire à l’épuisement cellulaire NK par l’étude des différentes voies métaboliques^10,11. La corrélation entre le statut métabolique des cellules NK et la fonction est très importante du point de vue de l’immunothérapie contre le cancer. Dans ce domaine, l’activation des cellules NK avec perfusion d’IL-15, seule ou en combinaison avec des anticorps thérapeutiques monoclonaux ont été testées afin d’améliorer la cellule tumorale tuant^12,13,14. La connaissance de l’état métabolique des cellules NK en réponse à ces stratégies de traitement fournirait un prédicteur précieux de l’état d’activation des cellules NK et de la fonction de mise à mort.

L’étude des voies métaboliques dans d’autres cellules myéloïdes et lymphoïdes telles que les monocytes, les cellules T et B a été décrite¹⁵ et des méthodes optimisées ont été publiées¹⁶. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode qui combine à la fois un protocole d’isolement NK qui produit un nombre élevé de cellules NK pures et viables et un protocole optimisé pour mesurer l’activité métabolique à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Ici, nous montrons qu’il s’agit d’une méthode valable pour l’étude des changements métaboliques dans le repos et IL-15 activé cellules NK humaines. Pour l’essai de flux extracellulaire, des paramètres tels que le nombre de cellules et les concentrations de médicaments ont été testés et optimisés. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est entièrement automatisé et capable de tester en temps réel, avec de très faibles quantités de cellules, jusqu’à 92 échantillons simultanément, et permet ainsi des dépistages à haut débit (avec plusieurs échantillons et répliques) d’une manière relativement rapide¹⁷.

Cette méthode peut être utilisée par des chercheurs intéressés à évaluer la fonction cellulaire NK en étudiant le métabolisme des cellules NK. Il pourrait également être appliqué aux cellules activées par d’autres cytokines, anticorps ou stimuli solubles.