Involucro di grafene di cellule di mammiferi fissate chimicamente per la microscopia elettronica a fase liquida
Summary
Qui è presentato un protocollo per etichettare le proteine della membrana nelle cellule dei mammiferi e rivestire il campione con grafene per la microscopia elettronica a trasmissione a scansione in fase liquida. La stabilità dei campioni contro i danni causati dalle radiazioni può anche essere studiata con questo protocollo.
Abstract
Viene descritto un protocollo per studiare il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) nella membrana plasmatica intatta delle cellule del cancro al seno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM). Le cellule della linea cellulare skBR3 del cancro al seno dei mammiferi sono state coltivate su microchip di silicio con finestre di nitrato di silicio (SiN). Le cellule sono state fissate chimicamente e le proteine HER2 sono state etichettate con nanoparticelle di punti quantici (QD), utilizzando un protocollo di legame biotina-streptavidin in due passaggi. Le cellule sono state rivestite con grafene multistrato per mantenere uno stato idratato e per proteggerle dai danni del fascio di elettroni durante lo STEM. Per esaminare la stabilità dei campioni nell’irradiazione del fascio di elettroni, è stato eseguito un esperimento di serie di dosi. Sono stati confrontati campioni rivestiti di grafene e non rivestiti. Il danno indotto dal fascio, sotto forma di artefatti luminosi, è apparso per alcuni campioni non rivestiti ad una maggiore dose di elettroni D, mentre nessun artefatto è apparso su campioni rivestiti.
Introduction
L’analisi della funzione proteica della membrana è essenziale per la ricerca biologica cellulare e per lo sviluppo di farmaci. Una classe di importanti esperimenti prevede l’esame delle posizioni delle proteine della membrana nelle cellule. Queste informazioni possono essere utilizzate per dedurre conclusioni sull’assemblaggio di proteine in complessi proteici e sulle loro posizioni specifiche nella membrana plasmatica, che, tramite assemblaggio e smontaggio dinamico, guida un’ampia varietà di funzioni cellulari. Tra le altre tecniche, la microscopia leggera (LM) e la microscopia elettronica (EM) vengono utilizzate per studiare le funzioni proteiche nelle cellule. LM consente l’analisi di intere cellule in liquido; tuttavia, la risoluzione è limitata a 200-300 nm per la microscopia convenzionale e fino a 20 nm per la microscopia a fluorescenza super risoluzione in condizioni pratiche1,2. L’EM fornisce circa 1 risoluzione3, ma la preparazione convenzionale del campione richiede disidratazione, colorazione metallica per migliorare il contrasto dell’immagine e incorporamento in una sostanza di montaggio, come la resina, per la microscopia elettronica di trasmissione (TEM)4. Per conservare campioni biologici in un ambiente più nativo, è possibile utilizzare tecniche crio-EM5,6. I campioni vengono rapidamente congelati in ghiaccio amorfo e, se necessario, sezionati. Un’altra opzione è la frattura del congelamento EM7.
Tecniche EM per lo studio delle proteine della membrana all’interno di cellule intatte nel loro stato nativo, liquido sono emerse negliultimi dieci anni 8,9,10,11. Una risoluzione spaziale di 2 nm è stata raggiunta su proteine di membrana etichettate punto quantico (QD) in cellule intere coltivate su una membrana SiN e racchiuse da uno strato digrafene 9.
Qui, sono descritti i dettagli di un protocollo per l’etichettatura delle proteine e il rivestimentodi grafene 9,12. L’obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la distribuzione spaziale di HER2 nella membrana di cellule intere fisse, preservando le cellule in uno stato idratato. Il rivestimento con grafene impedisce l’essiccazione delle cellule nel vuoto e riduce anche il danno daradiazioni 13. Questo metodo fornisce informazioni sulle proteine della membrana etichettate all’interno della membrana plasmatica intatta, ma il metodo non è utile per studiare l’ultrastruttura cellulare come di solito viene fatto con EM.
Il grafene è il nanomateriale più sottile conosciuto, ed è costituito da un singolo foglio cristallino spesso atomo di carbonio disposto in un reticolo a nido d’ape14. Ha proprietà uniche tra cui alta flessibilità e resistenza meccanica. Recenti ricerche hanno dimostrato che il grafene privo di difetti è impermeabile ai gas e ai liquidi, ma i difetti consentono la permeazionedell’idrogeno 15. Questa perdita può essere ridotta utilizzando il grafene multistrato come usato qui. Il grafene bistrato ha recentemente dimostrato di essere utile come supporto per i campioni crio-EM, migliorando l’omogeneità dello strato di ghiaccio sottile rispetto all’ossido di grafene dove possono essere formati solo strati non uniformi16. È stato inoltre dimostrato che il grafene riduce il danno del fascio di campioni biologici durante la microscopia elettronica a trasmissione infase liquida 13,17. Come esperimento esemplare, HER2 espresso nella linea cellulare del cancro al seno dei mammiferi SKBR3 è stato etichettato con QD18 e la sua distribuzione spaziale registrata utilizzando STEM. Le cellule sono state seme su un microchip Si con una membrana SiNtrasparente elettronica 19. I microchip sono stati scelti come supporto in quanto robusti, compatibili con LM ed EM, e l’intera procedura di etichettatura può essere eseguita direttamente sul microchip19. Dopo l’attacco alla cella, HER2 è stato etichettato con un protocollo di etichettatura in duepassaggi 20. In primo luogo, un composto mimetico anticorpo anti-HER2 biotinilato21 è stato attaccato a HER2. Le cellule sono state quindi fissate chimicamente per prevenire il clustering dei recettori indotti dall’etichetta e per aumentare la stabilità dell’ultrastruttura cellulare. I QD rivestiti di Streptavidin sono stati successivamente collegati al complesso mimetico HER2-antibody. Il segnale di fluorescenza luminosa e il nucleo elettrone-denso dei QD hanno permesso la microscopia correlata alla fluorescenza e all’elettrone (CLEM)20. CLEM è particolarmente utile perché le regioni cellulari di interesse per l’analisi STEM possono essere selezionate dalle immagini di microscopia panoramica a fluorescenza che evidenziano la localizzazione di HER2 sulle cellule. Le cellule sono state analizzate mediante microscopia a fluorescenza per identificare le regioni cellulari con alti livelli di HER2. Successivamente, un foglio di grafene spesso 3-5 strati è stato trasferito sulle celle per il rivestimento9,22. Successivamente, il campione è stato montato in un supporto di campioni EM. I dati STEM sono stati acquisiti utilizzando il rivelatore di campo scuro anulare (ADF), fornendo informazioni sulla distribuzione spaziale di HER2 sulla superficie cellulare rispetto alla posizione della superficie cellulare, ma non fornendo informazioni sull’ultrastruttura della cellula. Per determinare la stabilità del campione nell’irradiazione del fascio di elettroni, i campioni sono stati esaminati a dose crescente (D) in una serie di immagini. È stata studiata la differenza tra campioni rivestiti di grafene e campioni non rivestiti. Sono stati valutati diversi tipi di danni da radiazioni.
Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare di cancro al seno di mammifero HER2 overexpressing SKBR3 come un sistema modello per il targeting HER223. Il protocollo include la preparazione di un campione rivestito di grafene e di un campione simile, ma senza rivestimento di grafene per il confronto. L’esperimento viene preparato in duplicato poiché la finestra SiN può rompersi una volta ogni tanto e ottenere un duplicato sperimentale nella maggior parte dei casi. La resa complessiva del metodo è elevata, il che significa che i microchip con cellule coperte di grafene sono di solito ottenuti con un errore eccezionale anche se non l’intera finestra SiN può essere coperta di grafene in tutti i casi. I duplicati non sono descritti nel protocollo.
Il protocollo di etichettatura (passaggi da 1 a 5) è paragonabile al protocollo di etichettatura del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule fibroblasti COS7 pubblicate inprecedenza 24; dettagli in tale documento sono indicati per quanto riguarda la manipolazione dei microchip, e l’uso delle piastre del pozzo. Il seguente protocollo è ottimizzato per l’etichettatura HER2, rivestimento digrafene 9ed esame della tolleranza alle radiazioni del campione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per comprendere meglio la funzione proteica, è importante ottenere informazioni sulle posizioni delle proteine nella membrana plasmatica delle cellule intatte. I metodi per ottenere queste informazioni includono la microscopia a fluorescenzasuper-risoluzione 1,2. Anche se la microscopia super-risoluzione si è ulteriormente sviluppata negli ultimi anni, la sua risoluzione è ancora limitata a circa 20 nm per le condizioni pratiche degli esperimenti cellulari, mentre le proteine recettoriali tipiche hanno dimensioni nell’intervallo di 1-10 nm. L’imaging delle proteine a livello di singola cellula e singola molecola con una risoluzione sufficiente per visualizzare le proteine è possibile con EM. Ma a causa del sesscio, i metodi EM convenzionali in genere non lasciano la cellulaintatta 26, il che porta alla perdita di informazioni importanti sul contesto e la distribuzione spaziale delle proteine nella membrana plasmatica. Metodi per intere cellule con crio-TEM sono statisviluppati 6, è possibile combinare l’etichettatura delle proteine con crio-EM27, anche crio-STEM è stato dimostrato28. Tuttavia, i flussi di lavoro crio-EM sono ottimizzati per studiare l’ultrastruttura cellulare e la struttura proteica, e non tanto per analizzare le distribuzioni spaziali delle proteine della membrana. L’essiccazione dei punti critici è un altro metodo di preparazione dell’intera cellula, ma i campioni sono sottoposti a diversi passaggi di essiccazione e la tecnica richiedemolto tempo 29. Le proteine della membrana sono state esaminate anche tramite la frattura dicongelamento 7. In questo metodo, le cellule sono fisse, congelate e fratturate. Le parti fratturate vengono replicate da strati di carbonio e platino e il campione biologico viene rimosso. Le repliche possono quindi essere analizzate con EM30. L’analisi dell’intera cellula è impossibile con la frazione di congelamento perché le informazioni sulla distribuzione delle proteine nella membrana nel contesto dell’intera cellula vengono perse.
Il metodo qui presentato permette di studiare la membrana cellulare senza dover tagliare a sottile ilcampione 9,31. Le cellule sono mantenute intatte in modo che la localizzazione delle proteine della membrana sia visibile dalle immagini di fluorescenza, che sono correlate con le immagini EM. Lo studio delle proteine a livello di singola cellula e singola molecola all’interno di cellule intatte in stato idratato ha dimostrato di essere possibile con una risoluzione di 2 nm utilizzando STEM di proteine etichettate QD utilizzando questo metodo di recinzione di grafene9. Mantenere le cellule nel loro stato nativo è fondamentale, in quanto preserva la distribuzione spaziale delle proteine della membrana in modo tale che le analisi siano possibili a livello di singola cellula e singola molecola, che è importante per comprendere le funzioni proteiche e sviluppare nuovi farmaci per gli approcci terapeutici.
Un altro aspetto critico dell’imaging di campioni biologici con EM è il danno da radiazioni dei campioni causati dal fascio di elettroni. Le soluzioni spesso includono la riduzione del più possibile della dose di elettroni o vari metodi di rivestimento, come l’incapsulamento del campione tra sottili strati di carbonio32. Il nostro metodo mostra che il rivestimento di grafene riduce gli artefatti indotti dal fascio che emergono sulla superficie cellulare per i campioni non rivestiti. L’esame dei campioni biologici rivestiti chimicamente fissi e rivestiti di grafene è possibile sotto l’irradiazione del fascio di elettroni a 200 keV energia del fascio fino a D – (7,8-0,4) x 103 e–/2 senza danni da radiazioni, come macchie luminose, che appaiono sul campione. Rispetto ad altri metodi EM che comportano una preparazione elaborata del campione, ad esempio colorazione, incorporamento, sezionazione (crio-), fratturazione, ecc., il metodo qui descritto richiede meno tempo. L’etichettatura delle proteine viene eseguita entro poche ore e il rivestimento del grafene richiede solo circa 15 minuti per i ricercatori qualificati. La preparazione del campione è paragonabile alle procedure necessarie per la microscopia a fluorescenza.
Il protocollo può essere modificato in alcuni passaggi. Il grafene sul microchip può anche essere essiccato all’aria per assicurarsi che il grafene non si muova quando è macchiato da una carta da filtro. Se il grafene è contaminato dal sale, è possibile lasciarlo galleggiare sulla superficie dell’acqua per circa un’ora per sciogliere il sale e quindi ridurre al minimo la contaminazione. La contaminazione da rame o PMMA sul grafene può essere ridotta estendendo le corrispondenti fasi di incisione nel protocollo. Altri metodi di rivestimento del grafene sono stati descritti dove, ad esempio, il grafene-PMMA è stato depositato direttamente sulle cellule, e il PMMA è stato rimosso lavando in acetone inseguito 33. Nel nostro metodo, PMMA è stato rimosso prima del rivestimento per evitare eventuali danni alle cellule causati da ulteriori passaggi di lavaggio dell’acetone. NaCl è stato scelto come substrato qui perché è piatto, quindi non rughe il grafene, e si scioglie in acqua per rilasciare il grafene9. Inoltre, può essere tagliato nella dimensione desiderata e nessun residuo di substrato viene lasciato sul grafene. Ma tenendo conto di questi criteri, possono essere utilizzati anche altri substrati come il cloruro di potassio.
Per ridurre la possibilità di un potenziale clustering indotto dall’etichetta, la fase di fissazione GA può essere implementata direttamente dopo la fissazione della FA, dopo di che tutte le proteine della membrana vengono immobilizzate. Il primo passo di fissazione con FA fissa già la struttura biologica, ma un livello ridotto di diffusione della proteina della membrana puòancora verificarsi 34, possibilmente portando al clustering indotto dall’etichetta a causa della presenza di più Streptavidin per QD. La fissazione con GA può portare a un segnale di autofluorescenza durante LM, ed è, pertanto, fatto dopo LM nel protocollo descritto, ma può essere ridotto come descrittoaltrove 34. Buffer cacodilato è abbastanza tossico, e altri fissativi possono essere utilizzati pure, ma cacodylate viene utilizzato qui come è un buffer comunemente usato per protocolli EM, evita precipitati, impedisce la crescita di batteri e funghi, ed è compatibile con gli ioni di calcio che sono necessari per preservare l’integrità ultrastrutturale delle membranelipidiche 35. Se necessario, l’osmio tetroxide può essere utilizzato come fissazione aggiuntiva per stabilizzare i lipidi. Ciò contribuirebbe a migliorare il contrasto della struttura cellulare, ma aggiungerebbe anche un altro metallo al sistema e ridurrebbe il contrasto ottenuto sui QD.
Il protocollo descritto di seguito contiene molti passaggi che richiedono una buona istruzione. È necessario un certo allenamento prima di maneggiare microchip per evitare di graffiare la superficie SiN dei microchip e per prevenire la rottura. Come accennato in precedenza, si consiglia di preparare microchip in duplicati in quanto la finestra SiN può rompersi di volta in volta. Ottenere il numero richiesto di cellule su un microchip richiede anche una certa esperienza. Rivestire le cellule con grafene ha bisogno di un po ‘di formazione in quanto può essere difficile trovare l’angolo di inclinazione destra per galleggiare grafene sull’acqua. Quando si cattura il grafene dall’acqua, può anche essere difficile vedere il grafene sottile. Non appena il grafene è sul microchip, l’acqua in eccesso deve essere cancellata con una carta da filtro. Questo dovrebbe essere fatto solo con la punta di una carta da filtro tale da evitare di rimuovere il grafene dal microchip.
Il rivestimento del grafene ha impedito la visualizzazione di artefatti sul campione. Ma per D < 4 x10 2 e –/2 non sono emersi artefatti per il campione non rivestito, e gli artefatti sono apparsi solo per 2 campioni non rivestiti.– Pertanto, anche gli esami delle cellule non rivestite sembrano possibili, anche se sarebbe meglio usare il grafene ed evitare il rischio di formazione di artefatti. La composizione di questi manufatti può essere analizzata in futuro per dare suggerimenti su come prevenire la loro formazione. Per quanto riguarda la stabilità strutturale delle cellule è stato osservato solo un piccolo miglioramento del rivestimento di grafene. Le cellule fisse erano apparentemente stabilizzate nelle aree sottili esaminate, dove la loro struttura era in prossimità della membrana SiN. Ciò che non abbiamo esaminato qui, tuttavia, erano artefatti di essiccazione che sono noti per verificarsi per campioni cellulari quando esposti al vuoto4. L’essiccazione delle cellule porterebbe al restringimento delle cellule in modo che anche le distanze QD cambino di conseguenza. Per la dose di elettroni qui utilizzata, la distanza dei QD di campioni rivestiti di grafene e non rivestiti è rimasta stabile. Sono necessari ulteriori studi per esaminare l’effetto del rivestimento di grafene sulle cellule per EM.
Una limitazione di questo metodo è che la fissazione chimica delle cellule è necessaria; pertanto, non è possibile eseguire esperimenti in cellule vive. Ma nel caso in cui l’etichettatura non sia necessaria e si usino cellule con una maggiore stabilità strutturale, ad esempio i batteri, le cellule non rappresentate possono essere racchiuse nel grafene per EM36 anche se con una diversa tolleranza alla dose di elettroni. Inoltre, le proteine non sono rilevabili direttamente, quindi sono necessari QD per visualizzare le proteine. Il metodo trarrebbe vantaggio da etichette più piccole. Un punto di discussione è se è buono o cattivo che l’ultrastruttura non sia chiaramente visibile. Il nostro metodo è simile a quello della microscopia a fluorescenza in cui sono visibili solo le proteine selezionate37. Aumentando la visibilità dell’ultrastruttura si aggiungono anche molte più informazioni all’immagine, e quindi a un certo punto si impedisce il rilevamento delle singole posizioni delle etichette. Inoltre, il metodo qui descritto è per una specie proteica, e sono necessarie aggiunte del protocollo per essere in grado di etichettare più proteine. Infine, il metodo funziona quando è disponibile una piccola molecola ad alta affinità che lega specificamente molecola come l’anticorpo mimetico21 o nanocorpo38. Gli anticorpi comunemente usati sono molto più grandi e impedirebbe il rilevamento dello stato funzionale delle sottounità proteiche negli oligomeri.
Il nostro metodo è utile per studiare la funzione proteica su cellule intere utilizzando EM mantenendo le cellule in stato idratato. È facilmente possibile esaminare serie di cellule. Altri tipi di cellule e proteine possono essere studiati pure. Se non è necessaria l’etichettatura delle proteine, un sottoinsieme del protocollo può essere utilizzato per il rivestimento di grafene di un’ampia varietà di campioni biologici. La capacità di studiare intere cellule è rilevante nella ricerca cellulare per comprendere le correlazioni della funzione della proteina della membrana a livello molecolare.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo D. B. Peckys per l’aiuto con il protocollo di coltura cellulare, F. Weinberg per la revisione del manoscritto, T. Trampert per aiuto con gli esperimenti e le figure, S. Smolka per aiuto con le figure, e E. Arzt per il suo sostegno attraverso INM. Questa ricerca è finanziata da Else Kroner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| Acetone for HPLC (min. 99.8 %) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2626-1L | |
| AL54 analytical balance | Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany | 30029077 | |
| Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 0163.2 | |
| Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM | Affibody, Solna, Sweden | 10.0817.02.0001 | |
| atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F | JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany | ||
| Boric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | B6768-500G | |
| Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 5169.1 | |
| Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696781 | |
| Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696782 | |
| Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696792 | |
| Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696794 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188271 | |
| CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 627861 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 5401000010 | |
| Centrifuge Tubes 50 ml sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696705 | |
| Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution | Corning, NY, USA | 25-056-CI | |
| D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 9286.1 | |
| Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | PK36.1 | |
| Easypet | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 4430000018 | |
| Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 – 2.5 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000012 | |
| Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus pipette variable, 10 – 100 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000047 | |
| Eppendorf Research plus pipette variable, 100 – 1000 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2222-1L | |
| Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | F8141 | |
| Fluorescence Microscope Leica DMI6000 | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | ||
| Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 31966021 | |
| Gibco Fetal Calf Serum (FCS) | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 10099141 | lot number: 1751893 |
| Gibco Goat Serum, New Zealand origin | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 16210064 | lot number: 1788320 |
| Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Galaxy 48R CO2 Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | CO48310001 | |
| Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner | Gatan GmbH, München, Germany | ||
| Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | G5882 | |
| Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | T873.1 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | DM IL LED | |
| Hot plate | Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany | MR 3002 | |
| MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine | Biowest, Nuaillé, France | X0557-100 | |
| Microscope glass slides 76 mm x 26 mm | DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main | ||
| micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752 | |
| MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | ||
| Ocean Microchips SiN window 400×150 µm, 200 nm spacer | DENSsolutions, Delft, The Netherlands | ||
| Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 | purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe |
| Oven | Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany | VO 200 | |
| Parafilm | VWR, Darmstadt, Germany | #291-0057 | |
| Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15710 | |
| Perfekt-Kescher with handle | Plano GmbH, Wetzlar, Germany | T5112 | |
| Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2-200µl: 7695892 | |
| Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887 | |
| Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 – 150.000 | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | P4707 | |
| Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM | Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | Q10121MP | |
| Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased | Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA | 94-0451 | |
| round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm | Schleicher & Schuell, Dassel, Germany | 300212 | |
| Routine stereo Microscope Leica M60 | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | M60 | |
| Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1 | |
| Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553 | |
| Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555 | |
| Shaking water bath SW22 | Julabo GmbH, Seelbach, Germany | 9550322 | |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | HN00.1 | |
| Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm | International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA | 9750 | |
| Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | S9640-500G | |
| Sodium persulfate | carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 4365.2 | |
| syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | P668.1 | |
| Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm | ACS material, Pasadena, CA, USA | TTG30011 | |
| Tweezers Dumoxel 03 | Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland | 0103-7-PO | |
| Tweezers Inox 02 | Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland | 0102-7-PO | |
| Tweezers, plastic replaceable tip | Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland | 5SVR.SA | |
| Water ROTISOLV HPLC gradient grade | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | A511.2 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Williams, D. B., Carter, C. B. . The Transmission Electron Microscope. , (2009).
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
- Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
- Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
- Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
- Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
- Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
- Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
- Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
- Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
- Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
- Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
- Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
- Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
- Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
- Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
- Kohl, H., Reimer, L. . Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).
- Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
- Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
- Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
- Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
- Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
- Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
- Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- Pawley, J. B. . Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).
- Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).
